丫蕊花组培及种植方法

专利名称：丫蕊花组培及种植方法
技术领域：
本发明属于植物组织培养和移栽种植技术领域，具体地，涉及百 合科植物丫蕊花新药材的组织培养技术和无公害种植方法。
背景技术：
丫蕊花植物在民间称石凤丹、随身丹，具有清热、解毒、散结、 利小便，主治痨疠、水肿，该属植物有四种，分别为丫蕊花(f. tAiZ et/ca ); 云南丫 '蕴花 (F- y〃/w2a/ e"57's迈ici-a/ t力a 泡W-ifez力；高山丫蔬花(F. a加'/7aet 7"朋g);小丫蕴花(F. cara7e2^'ei乙eW et ra/ zO，均属于在国内市场未上市的中药，已被 云南省食品药品监督管理局列入云南省中药材标准,2005年版彝族药 (ni)于2009年发布。现为天然植物。中国专利CN1081036C公幵了 以丫蕊花全草为原料，提取获得呋甾类甾体皂苷具有抗癌活性，该发 明专利亦被收载于美国化学文摘(Kawabc. et. al. CS 1996， 124: 325368y)。中国专利为03117694. 1公开了 丫蕊花属植物中甾体皂苷 具有治疗妇科出血性疾病的作用。
制药企业用丫蕊花为原料生产治疗妇科血症的新药后，市场上供 应丫蕊花中药材预计每年不低于4000-5000吨。仅依靠野生丫蕊花资 源，无法解决和满足消耗的需要。急需种植，实现丫蕊花资源的再生 和持续利用。由于丫蕊花花粉管由珠孔进入胚囊释放出两个精子属双受精过 程，受精后的合子休眠期较长，胚胎发育较慢，种子成熟时胚尚未分 化，胚仍需进一步缓慢发育，所以用种子繁殖没能成功，野外在丫蕊 花周囲也未发现幼小丫蕊花。为此中国专利申请"一种丫蕊花的人工
繁育方法"专利申请号为200610048655,1，公开了以丫蕊花叶为材料 进行人工繁殖技术研究获得成功，出苗率最高达67%。然而该技术由于 出苗率最高仅达67%，出苗率还是较低，而且该方法人工种植需要土地， 遮荫费时且投入大，不能满足大面积种植和对药材的大量需求。

发明内容
针对现在技术的上述不足，本发明提供一种丫蕊花组织培育和无 公害种植技术，采用本发明的方法，.可获得大批组培苗满足种植需要； 并采用天然林区种植克服农药及重金属污染，成活率达95.5% ，三 年内可提供新药材，単株重量高于同年野生和无繁种植药材2倍，并 且縮宫止血有效成分含量高于同年野生药材；并满足制药企业对原药 材的需求，既可成批培育又可大面积种植组培苗，并且提早二年获得 无公害药材，具有实用价值。
为了实现本发,明的目的，本发明提供了如下的技术方案 丫蕊花的组培及种植方法，包括取丫蕊花外植体，消毒清洗，愈 伤组织诱导与分化，不定芽增殖，不定根诱导，炼苗，无公害种植步 骤。
所述组织培养育苗是用叶组织离体培养育苗，剪下叶片，消毒后 接种在MS培养基上培养30天，形成愈伤组织并分化为丛芽，培养 的不定芽单个切开转接在培养基上增殖培养，形成增殖体的幼苗转接 到1/2MS + IBA 0.2 mg/L的培养基中，15-21天生根，练苗后移栽。丫蕊花外植体优选叶片，经水洗，70%的乙醇和升汞消毒，无菌 水洗净后，剪成小块，进行愈伤组织诱导与分化。
愈伤组织诱导与分化是在无菌条件下，从丫蕊花消毒后叶片上
剪下1平方厘米小叶块，接种在MS培养基加含6-BA 0. 25-0. 5mg/L， NAA 0. 2-0. 3 mg/L培养基上，在20-25°C ，光照1000Lx，光照10-12 小时，湿度大于70%条件下直接诱导产生丛芽，30-40天开始萌动； 再经8-14天有丛芽出现；7-15天丛芽长叶。
不定芽增殖是将愈伤组织诱导与分化出的丛芽单个切开，在MS培 养基加含6-BA 0. 5mg/L ， NAA 0. 3-0. 4 rag/L培养基上进行增殖培 养；40-60天便可形成幼苗；增殖培养产生的新丛芽，叶变绿，2-3cm 时，进一步转接进行增殖培养或继代培养。
不定根诱导是取出增殖培养长出的高4-5cm的幼苗，单个切开， 转接到1/2MS + IBA 0.2 mg/L培养基中，转接后15-21天，开始生 根；待40-60天根达3条以上，叶达6-IO片，高达6-8c迈的试菅苗 取出练苗。
炼苗是将试菅苗从组培室取出后置于温棚中，放置5-7天，取 出幼苗洗净培养基后移植在装有腐质土和红土 1:1并加少许腐质叶 为基质的营养袋内，浇水，在1000-2000Lx中光照8-12小时，湿度 大于70%条件下练苗1个月，当叶达6-10片，高达6-8cm时移栽种 植。
无公害种植是在天然条件下进行种植，选择海拔800 2，500m， 林下，沟边，瀑布两旁或有遮阴条件的荒土；满足日照年平均6小时 /日、年平均最高温度不高于18°C、月平均最高温度在11 23'C、最
6低可达0t:的条件；满足地下5cm 土温年平均最高温度不高于16°C、 月平均最高温度在9~2^)"、最低可达9。C以下的条件；建立隔离区，
防牛马进入而踏坏。
具体地，本发明技术方案可描述为
1、 材料
采集野生或家种丫蕊花全株移种在花盒中，以野生或家种丫蕊花 母体叶为外植体的材料。
2、 方法
1) .外植体消毒剪种于盒中的野生丫蕊花叶片，水冲洗丫蕊花
的母体组织叶片，经70%的乙醇和升汞消毒，无菌水洗净后，剪成lcm2 小方块，每瓶放4-6块外植体，盖紧瓶盖Z用保鲜袋封好瓶口。
2) 组培
① 培养基配制以MS为基本培养基，另加不同浓度的植物激素。由叶
片外殖体诱导产生愈伤组织，并诱导愈伤组织产生不定芽，J吏不定芽增殖，
不定芽形成幼苗，进行生根培养，采用加含6-BA 0.25-0.5mg/L (6-苄 基腺嘌呤)，NAA 0.2-0.4 mg/L ( N即hthalene acetc acid,萘乙酸) 和加含IBA 0.2 mg/L培养基，配制过程按照常规方法，培养瓶为玻 璃瓶或透明塑料瓶。灭菌采用121° C灭菌20分钟高压湿热灭菌。
② 组培条件
在20-25°C ，光照1000Lx，光照10-12小时，湿度大于70%条
件下
外殖体诱导产生愈伤组织形成产生不定芽30-40天。开始萌动后 8-14天出现丛芽；再过7-15天丛芽长叶。
7不定芽增殖取出已长叶丛芽单个切开进行增殖培养40-60天便
可形成幼苗。取其高4-5cm的幼苗进行生根培养。增殖培养产生的新 丛芽，叶变绿，2-3cm，可一进转接进行增殖培养或继代培养。
生根培养取出增殖培养长出高4-5cm的幼苗，单个切开，转接 到含IBA 0.2 mg/L培养剂中，转接后15-21天，开始生根。40-60 天根达3条以上，叶6-10片，高6-8cm的试菅苗可取出练苗。
③炼苗将试菅苗置于温棚中，控制光照和湿度下，放置5-7天， 取出试菅幼苗用清水洗净培养基移植在混有基质营养袋中，浇清水， 保湿l月成活后移栽在大田中，二年可收割。 3、种植
天然条件下的无公害种植。天然条件下的种植选择海拔
800 2，500m，林下，沟边，瀑布两旁或有遮阴条件的荒土，满足日照 要求年平均6小时/日；年平均最高温度不高于18'C，月平均最高 温度在11 23。C，最低可达0'C。地下5cm土温年平均最高温度不 高于16°C，月平均最高温度在^2(TC，最低可达9。C以下。
天然条件下种植，建立隔离区，防牛马进入而踏坏。本发明天然 条件下种植，4年收获，鲜重5-10克/株/年，有效成分含量1.3% (大于野生1.07%);仿生态种植，3年即可收获，鲜重15-30克/株/ 年，有效成分含量1.6%。 本发明的有益效果在于
采用本发明的方法，可获得大批组培苗满足种植需要；并采用天 然林区种植克服农药及重金属污染，成活率达95.5% ，三年内可提 供新药材，单株重量高于同年野生和无繁种植药材2倍，并且縮宫止血有效成分含量高于同年野生药材，具有推广的实用价值。可满足制 药企业对原药材的需求，既可成批培育又可大面积种植组培苗，并且 提早二年获得无公害药材，具有实用价值。


图1表示本发明丫蕊花母株叶作外植体；
图2表示本发明诱导愈伤组织图3表示本发明愈伤组织分化图4表示本发明生根；
图5表示本发明炼苗；
图6表示本发明盒栽种植；
图7表示本发明天然无公害种植。；
具体实施例方式
以下结合附图，通过本发明的实施例，对本发明的上述内容再做 进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于 以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术方案均属于本发明 的范围。
实施例1:
1、外植体材料的采取和处理
选择丫蕊花3-8月生长茂盛无病的母株新发幼嫩叶片叶为外殖 体材料。采集野生或家种丫蕊花全株移种在花盒中，用清水洗叶，待 新叶长出。从母株上剪下活叶片用自来水冲洗15分钟，除去叶表面 的尘土和绒毛，将叶片放入70%的乙醇中翻转20秒钟，除去叶表面 的蜡质物后用清水冲洗叶面除去乙醇，放入0. 1%升汞液中浸泡15分钟消毒，无菌水洗净后剪成lcm2小方块。叶背面平放于培养基中，每 瓶放4-6块外植体。盖紧瓶盖，用保鲜袋封好瓶口。在无菌操作台上完成接种。
2、 愈伤组织诱导与分化，不定芽增殖和不定根诱导
2. 1愈伤组织诱导与分化在无菌条件下，从消毒后叶片上剪下
l平方厘米小叶块，接种在MS培养基加含6-BA 0. 25-0. 5mg/L (6-苄基腺嘌呤)，NAA 0. 2-0. 3 mg/L ( Naphthalene acetc acid,萘乙酸) 培养基上，在20-25°C ，光照1000Lx，光照10-12小时，湿度大于 70%条件下直接诱导产生丛芽，30-40天开始萌动；再经8-14天有 丛芽出现；7-15天丛芽长叶。
2.2不定芽增殖:取出已长叶丛芽单个切开，在MS培养基加含6-BA 0.5mg/L ， NAA 0. 3-0. 4 mg/L培养基上，进行增殖培养。40-60天 便可形成幼苗。取其高4-5cm的幼苗进行生根培养。增殖培养产生的 新丛芽，叶变绿，2-3cm，可一进转接进行增殖培养或继代培养。
2.3不定根诱导取出增殖培养长出高4-5cm的幼苗，单个切开， 转接到1/2MS + IBA 0. 2 mg/L培养中，转接后15-21天，开始生根。 40-60天根达3条以上，叶6-IO片，高6-8cm的试菅苗可取出练苗。
3、 炼苗
将试菅苗从组培室取出后置于温棚中，放置5-7天，取出幼苗用 清水洗净培养基移植在营养袋中，营养袋内装有腐质土和红土 1:1混 均，加少许腐质叶为基质，绕清水，保湿控制光照1000-2000 Lx，光 照8-12小时，湿度大于70%条件下，练苗1月成活达92. 5%，叶6-10片，高6-8cm移栽在大田中。二年可收割。练苗后按照实施例2的 条件移栽，6个月时鲜重12克/株， 一年后，测定縮宫止血成分的含 量达1.6%， 二年可收割地上部分药用。
4、种植 天然条件下种植
选择海拔80(T2，500m，林下，沟边，瀑布两旁或有遮阴条件的成 遍土地。满足日照要求0~8小时/日，年平均6小时/日，株行距依 环境而定，可稀，可密。
气候条件气温年平均最高温度不高于1S。C，月平均最高温 度在1广23"，最低达0"。地下5cm土温最高温度年平均不高于 16°C，月平均最高温度在9 20 °C，最低达9'C以下。湿度最高达 90%，最低不低于70%，月平均湿度在70 90%之间，天然树遮阴。天 然条件下种植，建立隔离区，防牛马进入而踏坏。
综上，本发明提供的栽培方法出苗率高，成活率高90%，实现了 野生丫蕊花家栽。为丫蕊花成为新中药材，大量使用提供了较实用的 方法。
权利要求
1、丫蕊花组培及种植方法，包括取丫蕊花外植体，消毒清洗，愈伤组织诱导与分化，不定芽增殖，不定根诱导，炼苗，无公害种植步骤。
2、 根据权利要求l所述的方法，其特征在于所述组培是用叶组织离体培养育苗，剪下叶片，消毒后接种在MS培养基上培养30 天，形成愈伤组织并分化为丛芽，培养的不定芽单个切开转接在培养 基上增殖培养，形成增殖体的幼苗，转接到1/2MS + IBA 0. 2 mg/L的 培养基中，15-21天生根，练苗后移栽。
3、 如权利要求l所述的方法，其特征是丫蕊花外植体优选叶片， 经水洗，70%的乙醇和升汞消毒，无菌水洗净后，剪成小块，进行愈 伤组织诱导与分化。
4、 如权利要求l所述的方法，其特征在于愈伤组织诱导与分化 是在无菌条件下，从丫蕊花消毒后叶片上剪下1平方厘米小叶块，接 种在MS培养基加含6-BA 0. 25-0. 5mg/L， NAA 0. 2-0. 3 mg/L培养 基上，在20-25°C ，光照1000Lx，光照10-12小时，湿度大于70% 条件下直接诱导产生丛芽，30-40天开始萌动；再经8-14天有丛芽 出现；7-15天丛芽长叶。
5、 如权利要求l所述的方法，其特征在于不定芽增殖是将愈伤组 织诱导与分化出的丛芽单个切开，在MS培养基加含6-BA 0.5mg/L ， NAA 0.3-0.4mg/L培养基上进行增殖培养；40-60天便可形成幼苗； 增殖培养产生的新丛芽，叶变绿，2-3cm时，进一步转接进行增殖 培养或继代培养。
6、如权利要求1所述的方法，其特征在于不定根诱导是取出增殖培养长出的高4-5cm的幼苗，单个切开，转接到1/2MS + IBA 0.2 mg/L培养基中，转接后15-21天，开始生根；待40-60天根达3条 以上，叶达6-IO片，高达6-8cm的试菅苗取出练苗。
7、 如权利要求1或6所述的方法，其特征在于炼苗是将试菅苗 从组培室取出后置于温棚中，放置5-7天，取出幼苗洗净培养基后移 植在装有腐质土和红土 1:1并加少许腐质叶为基质的营养袋内，浇 水，在1000-2000 Lx中光照8-12小时，湿度大于70%条件下练苗1 个月，当叶达6-IO片，高达6-8cm时移栽种植。
8、 如权利要求l所述的方法，其特征在于无公害种植是在天然 条件下进行种植，选择海拔800 2，500m，林下，沟边，瀑布两旁或 有遮阴条件的荒土；满足日照年平均6小时/日、年平均最高温度不 高于1『C、月平均最高温度在1广23。C、最低可达0。C的条件；满足 地下5cm 土温年平均最高温度不高于16°C、月平均最高温度在9~20 °C、最低可达9。C以下的条件；建立隔离区，防牛马进入而踏坏。
全文摘要
本发明提供用丫蕊花的母体组织叶为外植体材料，进行组织离体培养和无公害种植物的方法，采用本方法可获得大批组培苗，满足种植需要。采用天然林区种植克服了农药及重金属污染，成活率达95.5％，三年内可提供新药材，单株重量高于同年野生和无繁种植药材2倍，并且缩宫止血有效成分含量高于同年野生药材，满足制药企业对原药材的需求。既可成批培育又可大面积种植组培苗，并且提早二年获得无公害药材，具有推广的实用价值。
文档编号A01H4/00GK101473792SQ20091009405
公开日2009年7月8日 申请日期2009年1月23日 优先权日2009年1月23日
发明者伟 倪, 刘海洋, 贺树珍, 陈昌祥 申请人:中国科学院昆明植物研究所