一种富士苹果组培苗锈果类病毒脱除方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于果树脱毒种苗培育技术领域，特别涉及一种苹果组培苗锈果类病毒脱 毒方法。
【背景技术】
[0002] 苹果作为我国农业部规划的11大优势农产品之一，目前我国栽培总面积3150万 亩、总产量2050万吨，总面积以及总产量分别占世界39. 8%、34. 7%，栽培面积和产量高居 世界第一，是世界上最大的苹果生产国。苹果生产在促进我国农业增效、农民增收和农业经 济发展中具有举足轻重的地位。
[0003] 苹果锈果病又称花脸病、裂果病，是危害苹果、梨等仁果类果树的主要病毒，在我 国各苹果产区均有发生，其中陕西、晋中部分果园病株率高达60%~80%。苹果锈果病是 由类病毒引起的一种病毒病。类病毒（viroid)是一种最小的具有侵染性的致病病原，它是 由246-371核苷酸组成的单链、共价闭合的环状RNA，具有一个小的富含GC的基因组，不能 编码蛋白，能引起许多经济作物产生严重病害。在苹果生产中存在的苹果锈果类病毒、苹果 缩果类病毒、苹果凹果类病毒，这3种都属于苹果锈果类病毒属、Pospiviroidae科。其中 苹果锈果类病毒曾对中国和日本的苹果和梨生产造成了重要的经济损失。
[0004] 苹果锈果病的症状主要表现在果实上，有些品种的幼苗和枝干上也可表现症状。 果实上的症状主要有三种类型，即锈果型、花脸型及混合型。苹果品种间对锈果病的抗性存 在差异。黄魁、黄龙等品种高度耐病，不表现明显症状；金冠、祝光等品种较耐病，发病后损 失较小；红玉等品种轻度感病；倭锦、印度、大国光中度感病；而国光、红星、元帅、青香蕉等 高度感病，发病后几乎完全失去经济价值。而且苹果树感染后，严重影响树体的生长，降低 果实产量和品质，阻碍根系对土壤营养物质的吸收和利用，对果树生产带来危害严重。由于 类病毒在寄主植物细胞核中复制和累积，在感病寄主的叶、茎、皮、砧木，以及果实的表皮、 果肉和种子中均可检测出类病毒，属于系统感染，一旦感染便会终身带毒，长期受害，常规 防治无法将病毒病根除，目前尚无有效的药剂防治和治疗方法，因此，培育脱毒苗木是防治 苹果病毒病的唯一有效措施。
[0005] 无毒苗木可应用于任何苹果栽培地区，不受自然条件的约束，对果树栽培技术也 无特殊要求，果树投产以后，不必增加任何防治措施和生产费用，便可明显改善品质，提高 产量，获得显著的经济效益。目前，应用于果树脱毒的方法主要有热处理、茎尖组织培养、热 处理结合茎尖组织培养、茎尖微体嫁接（MGST)、花药培养、抗病毒药剂、超低温结合茎尖组 织培养法。但是在文献报道中，这些方法的对苹果锈果类病毒脱毒效率较低，得到的脱毒品 种有限。
[0006] 申请号为"201410608611"，名称为"苹果组培苗热处理结合化学处理的脱毒方法" 的中国发明专利，公开了将苹果组培苗茎尖接种于含15-25 μ g/mL利巴韦林的培养基中， 升温至34-36Γ条件下进行恒温热处理。但其说明书中未说明利用此方法进行苹果锈果类 病毒脱除效果及其进行病毒处理的实验材料品种。
【发明内容】
[0007] 为了解决以上现有技术中对富士苹果组培苗锈果类病毒脱除效果差，生产中富士 苹果脱毒种苗较少的问题，本发明提供了一种对富士苹果组培苗锈果类病毒脱除效果好， 植株存活率高，所需时间短的脱毒方法。
[0008] 本发明提供的技术方案如下：
[0009] -种富士苹果组培苗锈果类病毒脱除方法，其特殊之处在于：包括以下步骤：
[0010] (1)离体植株无菌体系的建立：采集外植体幼芽，经75%酒精和0. 1%升汞消毒 后；将幼芽接种于灭菌后的初代培养基中，然后置于人工气候室中培养至18-20d，建立离 体植株无菌营养繁殖体系；
[0011] (2)继代培养：将步骤（1)中获得的离体植株转接继代培养基进行增殖培养，经过 30d后可产生大量丛生芽；继代培养：在无菌条件下，将成功入瓶的试管苗转移至继代培养 基中，连续继代培养多代，以繁殖获取足量的丛生芽，用于各种脱毒处理；
[0012] (3)茎尖组织的超低温处理结合化学处理脱毒：将步骤（2)中的继代培养的带毒 离体植株转入MS+6-BA 1. Omg/mL+IBA 0· 2mg/mL培养基上培育20~25d，取株高1. 0~ 2. 0cm的再生芽，将其分成单芽后，接种到MS+0. 4mol/L蔗糖+0. 4mol/L甘油的培养基上，培 养2d ;剥取2mm茎尖经过超低温（_196°C )处理后放入含20~25ug/L利巴韦林茎尖分化 培养基上培养，至苗高3cm左右。
[0013] (4) RNA提取和病毒检测：取步骤（3)中叶片进行病毒RT-PCR检测，统计脱毒效 率，采用EASY spin植物RNA快速提取试剂盒的液氮研磨法提取植物总RNA，反转录成cDNA， 利用苹果锈果类病毒引物进行RT-PCR检测。
[0014] 进一步地，在步骤（1)中所述初代培养基的配方为：MS+0. lmg/L ΙΒΑ+0. 5mg/L 6-BA+ 琼脂 5· 1 ~5. 3g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5· 8。
[0015] 进一步地，在步骤（1)中所述人工气候室中的培养环境为：温度25±2°C，光照 30001x，光照 16h。
[0016] 进一步地，在步骤⑵中所述继代培养基的配方为：MS+0. 3mg/LNAA+0. 9mg/L 6-BA+O. 6mg/L GA+ 琼脂 5· 1 ~5. 3g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5· 8。
[0017] 进一步地，在步骤（3)中所述茎尖培养基的配方为：MS+0.4mg/L IBA+2.0mg/L 6-BA+ 琼脂 5· 1 ~5. 3g/L+ 蔗糖 30g/L，ρΗ5· 8。
[0018] 进一步地，步骤（4)中苹果锈果类病毒检测引物序列为：
[0019] 正向引物：5，-AGACCCTTCGTCGACGACGA-3，；
[0020] 反向引物：5，-TGTCCCGCTAGTCGAGCGGA-3，。
[0021] 本发明的有益效果：使用本发明的技术方法，富士苹果锈果类病毒脱除率达到 75%以上，褪绿叶斑病毒脱除率达到95%以上，苹果茎沟病毒和苹果茎痘病毒脱除率达到 100%。植株存活率达到93%以上，获得一个脱毒品种仅需要150天左右。
【附图说明】
[0022] 图1为本发明的方法流程图。
【具体实施方式】
[0023] 为了更好的理解本发明，下面结合附图以及具体实施例来进一步说明。实验品种 为2001富士和美乐富士。
[0024] 实施例1 :
[0025] 本发明提供的高效进行富士苹果组培苗锈果类病毒脱除方法，包括以下4个步 骤：
[0026] 步骤1、离体植株无菌体系的建立：5月份初，在田间采集幼芽，用无菌水冲洗3次， 在超净工作台进行无菌操作。将幼芽在75%酒精进行30s~40s的表面消毒，之后无菌水 冲洗3次；再利用0. 1 %氯化汞处理10~12min，处理的时间因材料的木质化程度而有所差 异，之后无菌水进行4~6次的充分洗净；将幼芽接种于灭菌后的初代培养基中，本发明采 用的初代培养基配方为：MS+琼脂5. 1~5. 3g/L+蔗糖30g/L，pH5. 8,然后置于人工气候室 中培养，培养环境为：温度25±2°C，光照30001x，光照16h。培养至20d左右，外植体开始 萌动、生长，由此建立离体植株无菌营养繁殖体系。
[0027] 步骤2、继代培养：在无菌条件下，将成功入瓶的试管苗转移至继代培养基中，本 发明采用的继代培养基配方为：MS+0. lmg/L ΙΒΑ+0. 5mg/L 6-BA+琼脂5. 1~5. 3g/L+蔗糖 30g/L，pH5. 8,经过30d后可产生大量丛生芽。连续继代培养多代，以繁殖获取足量的丛生 芽，用于各种脱毒处理。处理品种为：2001富士和美乐富士。
[0028] 步骤3、茎尖组织的超低温处理结合化学处理脱毒：
[0029] (1)超低温处理：将继代培养的带毒离体植株转入MS+6-BA 1. Omg/mL+IBA 0. 2mg/mL培养基上培育20~25d，同时，在培养期间随机取再生芽中的单芽检测确定带毒。 取株高1. 0~2. Ocm的再生芽，在超净工作台上将其分成单芽后，接种到MS+0. 4mol/L蔗糖 +0. 4mol/L甘油的培养基上，预培养时间2d ;在解剖镜下剥取含2~3层叶原基大小约2mm 的茎尖，将该茎尖放在60%玻璃化溶液PVS2中，25°C下处理20min ;立即将茎尖转入经玻 璃化溶液PVS2(MS+30%甘油+15%乙二醇+15%二甲基亚砜+0. 4M蔗糖，pH5. 8)中，0°C处 理lOOmin，更换1次PVS2溶液后，迅速投入液氮，保存70min ;从液氮中取出茎尖，快速置于 40°C水浴中化冻90s，然后用1. 2M蔗糖培养液处理lOmin，重复洗涤一次，直至茎尖漂浮于 液体表面。
[0030] (2)化学处理：将洗涤后的茎尖放置含利巴韦林20~25ug/L茎尖分化培养基上 暗培养7d，然后转移至组培室光照40 μ mols i 2条件下培养。30d后根据莖尖生长情况更 换化学培养基。
[0031] 待苗长至3cm时，取叶片进行病毒RT-PCR检测，统计脱毒效率。
[0032] 步骤4、RNA提取和病毒检测
[0033] 采用EASY spin植物RNA快速提取试剂盒的液氮研磨法提取嫩叶的RNA ;采用 Thermo反转录试剂盒进行RNA反转录。
[0034] 病毒检测所用引物见表1，均由生工生物工程（上