专利名称：一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种抗肿瘤的药物组合物，还涉及该药物组合物的制备方法。
背景技术：
一些活细菌被发现在肿瘤组织中聚集已经约有150的历史了，而有目的的将这些细菌的这一特性运用在肿瘤治疗的研究中是从上世纪中期开始的。在这方面，研究最为深入的是三种细菌沙门氏菌、厌氧芽孢杆菌和双歧杆菌。其中，厌氧芽孢杆菌和双歧杆菌主要在肿瘤坏死部位繁殖，并且其亲肿瘤性依赖于肿瘤体积的大小[Dang LH，Beltegowda C，Huso DL，et al.Combinationbacteriolytic therapy for the treatment of experimental tumors.PNAS 2001；9815155-60]。沙门氏菌是兼性厌氧细菌，既可以生长在肿瘤坏死部位，也可以在活的肿瘤组织处生长，而且其亲肿瘤性不依赖于肿瘤的大小。(Ming zhao，meng Yang，Xiao-Ming，et al.Tumor-targeting bacterial therapy with amino acid auxotrophs ofGFP-expressing Salmonella typhimurium.PNAS.2005；102755-60.)。在对啮齿动物的实验中发现，厌氧芽孢杆菌和双歧杆菌在肿瘤组织中聚集并不能导致肿瘤的消退。经过减毒的沙门氏菌具有一定的抗肿瘤作用。(Low KB，Ittensohn M，Let，et al.VNP20009，a genetically modified Salmonella typhimurium for the treatment of solid tumors.Proc Am Assoc Cancer Res 1999；40.)基于这些细菌具有的亲肿瘤性，越来越多的研究倾向于将它们作为载体携带抗肿瘤基因发挥抑瘤作用，所传递的抗肿瘤基因包括前药转化酶基因、细胞因子、血管生成抑制剂等，但这些细菌本身的毒性，限制了其在抗肿瘤方面作用的发挥。
目前关于细菌在实体瘤聚集的机制仍然不清楚。最初认为是由于实体瘤组织产生的厌氧环境有利于厌氧细菌的生长而导致细菌在肿瘤生长。1997年发现沙门氏菌也具有亲肿瘤性，后来实验证实沙门氏菌的生长遍布整个肿瘤组织(Ming zhao，meng Yang，Xiao-Ming，et al.Tumor-targeting bacterial therapy with aminoacid auxotrophs of GFP-expressing Salmonella typhimurium.PNAS.2005；102755-60)，否定了上述最初的假设。现在较为认可的一种说法是肿瘤组织为细菌生长提供了免疫抑制的环境，从而有利于细菌生长，但依然未得到证实。
有研究发现大肠杆菌能够在肿瘤部位聚集(Yong A Yu，Shahrokh Shabahang，Tatyana M Timiryasova，et al.Visu lization of tumors and metastases in live animalswith bacteria and vaccinia virus encoding light-emitting proteins.NatureBiotechnology 2004；22313-21)，但并未公开有关大肠杆菌的详细数据。细菌富集重金属离子早有报道，现在可以通过基因工程的方法提高细菌富集重金属离子的能力(Pavel Kotrba，Lucie Doleckova，Victor de Lorenzo，et al.Enhancedbioaccumulation of heavy metal ions by bacterial cells due to surface display of short metalbinding peptides.Applied and Environmental Microbiology 1999；651092-1098；)，但主要是用于环境污染的治理，尚无利用细菌这一特性用于肿瘤的治疗。以前的报道主要是关于细菌富集重金属离子，关于细菌是否可以吸附重金属螯合物尚无报道。顺铂是金属螯合物，是目前一线抗肿瘤药，临床证明具有良好的抗实体瘤作用。但顺铂对人体有较大的毒性，在大剂量应用时病人会出现各种副反应，如消化道反应、肾毒性、神经毒性和过敏反应等，在一定程度限制其抗肿瘤作用的发挥。如果将顺铂静脉滴注，药物会全身分布，并且很快代谢，无法特异性到达肿瘤部位发挥抑瘤作用，无法在肿瘤部位聚集较高的浓度，抗肿瘤作用无特异性。目前尚无关于利用大肠杆菌的肿瘤靶向性及富集重金属的能力发挥抗肿瘤作用的报道。
发明内容
为了解决目前顺铂抗肿瘤中对人体毒性大，和利用细菌的亲肿瘤特性进行抗肿瘤时细菌毒性高等问题，本发明公开了一种抗肿瘤的药物组合物，该组合物中含有富集有抗肿瘤物质的活体大肠杆菌。本发明的药物组合物中的大肠杆菌包括大肠埃希菌属的各个种或在此基础上经过遗传工程改造的大肠杆菌工程菌，例如DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802或K803等等，本发明的药物组合物中的抗肿瘤物质为顺铂，也可以为其它能被大肠杆菌富集的抗肿瘤物质。
本发明所述肿瘤可以为各种实体瘤，例如鼠黑色素肿瘤B16-F10、人肝癌BEL7405及SMMC7721、人前列腺癌PC-3、人乳腺癌MCF-7、人纤维肉瘤细胞HT1080、鼠膀胱肉瘤细胞MB-49及鼠神经胶质瘤C6等实体瘤等。
本发明还公开了上述药物组合物的制备方法，其中富集有抗癌物质的大肠杆菌的制备方法，包括如下步骤(1)将大肠杆菌在带有氨苄的LB培养基中培养至0.6～0.8；(2)在培养基中加入一定量的顺铂，使溶液顺铂含量为0.1mg/ml；(3)37℃振荡培养1小时后取出，用生理盐水洗涤，离心并重悬。
本发明通过实验，运用活体成像技术，意外地发现大肠杆菌不但具有肿瘤靶向性，而且具有富集抗肿瘤化疗药物顺铂的能力，并且其富集顺铂的剂量已经达到了治疗剂量。利用大肠杆菌的这些特性，使大肠杆菌富集一定量的顺铂，并且特异性聚集到肿瘤部位，发挥肿瘤诊断或治疗的作用。本发明的大肠杆菌在制备肿瘤治疗药物中的用途中肿瘤诊断是通过富集并耐受顺铂的大肠杆菌聚集于肿瘤组织实现的，肿瘤治疗是通过富集顺铂的大肠杆菌的肿瘤靶向能力聚集于肿瘤组织，发挥顺铂的抗肿瘤作用实现的。
本发明公开的药物组合物在肿瘤诊断或治疗中的作用是通过以下实验进行验证的。
首先检测大肠杆菌的肿瘤靶向性。
将带有荧光标记(LucABCDE)的质粒pXen-1分别转入不同种的大肠杆菌中，然后将转化有pXen-1质粒的大肠杆菌尾静脉注入荷瘤小鼠体内，经过一段时间后，运用活体成像体外观察细菌在体内定位，发现细菌在肿瘤组织持续存在，最长时间观察一月，发现细菌仍然在肿瘤组织大量聚集，而正常组织未观察到细菌聚集。检测的肿瘤类型可以为各种实体瘤，本发明选择了B16黑色素瘤、鼠神经胶质瘤、前列腺癌、肝癌、胃癌、肺癌等，发现细菌均可以在这些肿瘤组织中聚集。由此可以认为细菌对多种肿瘤具有靶向性。检测的大肠杆菌类型可以多种，本发明选择其中三种DH5α、BL21和HB101，由此也可认为多种大肠杆菌工程菌和经过减毒处理的菌株均具有肿瘤靶向性。
将肿瘤细胞尾静脉注入裸鼠体内，使裸鼠产生转移瘤。将大肠杆菌尾静脉注入小鼠体内，一段时间后，运用活体成像仪器对小鼠进行观察，发现细菌可以聚集在小鼠的转移瘤内，由此证实，细菌不仅对原发肿瘤具有靶向性，而且对转移肿瘤也具有靶向性。
然后检测不富集顺铂的单纯的大肠杆菌对于肿瘤的生长抑制作用。将大肠杆菌尾静脉注入荷瘤小鼠体内，观察一段时间后发现连续多次注射大肠杆菌的一组小鼠肿瘤得到明显抑制，只注射一次大肠杆菌组对肿瘤的抑制效果不明显。关于连续多次注射细菌对肿瘤有一定的抑制作用，申请人认为主要是由于连续注射的细菌在肿瘤部位与肿瘤组织争夺营养造成，是否还具有促细胞凋亡作用目前还不清楚。
本发明通过综合大肠杆菌的肿瘤靶向性，抗肿瘤特性和顺铂的抗肿瘤作用，利用ICP-MS检测了细菌对顺铂的富集能力以及富集了顺铂的细菌抗肿瘤作用。结果发现大肠杆菌和顺铂共孵育一段时间后会富集一定量的顺铂，当优化条件后，细菌会富集达到治疗剂量的顺铂。
将富集有顺铂的大肠杆菌尾静脉注入荷瘤小鼠体内，一段时间后，将小鼠处死，取出正常脏器和肿瘤，利用活体成像装置发现，经过顺铂处理后细菌仍在肿瘤聚集，在正常组织没有细菌聚集。利用ICP-MS检测肿瘤组织中的顺铂含量，发现在肿瘤局部有高浓度的顺铂，实验发现经过顺铂处理后不同种的大肠杆菌均可以在不同种的肿瘤组织中聚集。
将富集有顺铂的大肠杆菌尾静脉注入预先造成的转移瘤小鼠体内，一段时间后，运用活体成像仪器观察，发现经过顺铂处理后的大肠杆菌仍然可以定位在转移瘤组织。
基于上述实验，评价富集一定量顺铂的大肠杆菌对实体瘤的生长抑制作用。将大肠杆菌和顺铂共孵育一段时间后，或将大肠杆菌在一定量的顺铂中振荡培养，将一定量的大肠杆菌每隔一段时间由尾静脉注入荷瘤小鼠体内，绘制一段时间的肿瘤生长曲线。结果发现，注射富集有顺铂的大肠杆菌能够明显抑制肿瘤的生长，比注射未经顺铂处理过的大肠杆菌有更明显的抑制肿瘤生长作用。本发明还通过试验对比了单用小剂量顺铂对肿瘤的治疗效果，发现注射用顺铂处理过的细菌较直接注射小剂量的顺铂，对肿瘤生长有更加明显的抑制作用，并且注射用顺铂处理过的细菌的小鼠肿瘤中顺铂含量明显高于直接注射小剂量顺铂的小鼠。说明是由于细菌的亲肿瘤性，导致在小鼠肿瘤部位聚集高浓度的顺铂聚集。
以上各实验可以采用多种大肠杆菌，本发明选择了其中三种DH5α、BL21和HB101，检验的肿瘤可以包括各种实体瘤，本发明选择了其中三种肿瘤B16、神经胶质瘤和前列腺癌，均取得了一致的结果。
本发明发现当肿瘤体积还很小时大肠杆菌细菌就可以在其中聚集，由此可以利用大肠杆菌对肿瘤进行早期诊断。方法可以采用将荧光质粒或者绿色或红色荧光蛋白编码基因转入细菌体内，利用活体成像装置体外观察原发或转移的微小病灶。
本发明的富集顺铂的大肠杆菌加上药学上可接受的辅料，以保持大肠杆菌的活性及稳定性，制备用于肿瘤诊断或治疗的药物组合物。
本发明的药物组合物可以制成适于本发明所述大肠杆菌发挥抗肿瘤作用的各种剂型，如片剂、散剂、胶囊剂、栓剂、注射剂、混悬剂等，优选注射剂。
本发明的药物组合物的给药途径为口服、肌肉注射，静脉给药等多种，优选静脉给药，给药剂量为每公斤体重所需的药物组合物中含大肠杆菌5×108～1×1011cfu，优选5×109cfu。
大肠杆菌作为抗肿瘤载体富集顺铂用来诊断或治疗肿瘤具有许多优点。首先，经过基因工程改造过的大肠杆菌十分安全，不象其他细菌如沙门氏菌对人可以致病，必须经过减毒处理后才可使用，而且还有回复为野生型的潜在危险。其次，大肠杆菌容易购买，操作方便。顺铂作为一线的抗肿瘤药，在各医院均可以买到，价格适中。第三，大肠杆菌富集顺铂治疗肿瘤比单用相同剂量的顺铂治疗显示出更高的疗效，而且对转移肿瘤也有一定的抑制作用。并且大肠杆菌富集顺铂治疗肿瘤既可以使顺铂在肿瘤组织聚集，从而较低对正常组织的损伤，也可以降低顺铂的使用剂量，降低顺铂的副作用。富集有顺铂的大肠杆菌在肿瘤的生物治疗中显示出巨大的潜力，为肿瘤的治疗提供了一种十分有希望的治疗策略。
图1为利用活体成像仪器观测细菌在肿瘤中定位。B16肿瘤接种在小鼠右后腿皮下，图中发光处为肿瘤，注射剂量为1×109cfu/100μl，注射细菌为转化有pXen-1质粒的大肠杆菌DH5α。其中图A，B，C分别为注射细菌后第2天、第4天、第8天。其他细菌在另外两种肿瘤中聚集和图1类似，未展示。
图2为细菌在很小的肿瘤中聚集，注射细菌为转化有pXen-1质粒的大肠杆菌BL21，肿瘤为鼠神经胶质瘤，接种在小鼠右后腿皮下，解剖取出肿瘤发现肿瘤体积为100mm3。
图3为尾静脉注射1×107cfu/100μl转化有pXen-1质粒的大肠杆菌DH5α，肿瘤为B16，接种在小鼠右后腿皮下。两天后将小鼠处死，取出肿瘤，用活体成像仪器观察到细菌在肿瘤中聚集，图示为将肿瘤切开后显示肿瘤内发光情况。
图4为连续注射细菌对小鼠肿瘤的生长影响。注射细菌为转化有pXen-1质粒的大肠杆菌DH5α，注射剂量为1×108cfu/100μl，每次注射间隔7天。一次注射细菌组注射剂量和连续注射组相同。生理盐水注射剂量为100μl。
图5是大肠杆菌DH5α在不同的顺铂浓度和不同孵育时间对顺铂的富集量。设三个浓度，分别为0.1mg/ml、0.05mg/ml、0.01mg/ml。孵育时间分别为1小时、12小时，长期培养是指将细菌转接入含有一定浓度顺铂的LB培养基中，放入摇床，37℃，220转/分钟，直至细菌OD值达到1.5左右。
图6为小鼠双肺的转移肿瘤。肿瘤转移模型的建立见材料和方法。待小鼠转移模型形成后，尾静脉注射1×108cfu/100ul转化有pXen-1质粒的大肠杆菌DH5α，4天后，将小鼠处死，取出转移肿瘤，在活体呈像下观察。A为小鼠双肺转移肿瘤用数码相机拍摄的照片，肺组织上的黑色斑点即为肿瘤转移灶。B为小鼠双肺转移肿瘤的荧光照片，可见细菌在小鼠肺转移肿瘤大量聚集。
图7为连续注射富集了顺铂的大肠杆菌DH5α对B16肿瘤的生长抑制作用。注射剂量为2×108cfu/200μl。另一组连续注射的细菌为未吸附顺铂的大肠杆菌DH5α，注射间隔为7天，观察时间间隔为3天，连续观察了30天。
图8为连续注射富集了顺铂的大肠杆菌DH5α和注射小剂量顺铂10μg/天对小鼠肿瘤的抑制作用。大肠杆菌注射量为1×108cfu/100μl，顺铂每天尾静脉注射10μg。
图9为实验组和对照组肿瘤中的顺铂含量，每组肿瘤数5个，实验组和对照组各取5只小鼠。第一组小鼠连续注射富集了顺铂的细菌DH5α，第二组小鼠连续注射小剂量的顺铂100μg/天，第三组小鼠为对照组，注射100μl生理盐水。
具体实施例方式
实施例一 受体动物和肿瘤模型的建立1、材料和方法1.1细菌、细胞及其培养条件大肠杆菌DH5α、BL21和HB101均稳定整合有荧光质粒pXen-1，均购买自Xenogen公司。质粒pXen-1带有氨苄抗性，细菌在加有氨苄的培养基中生长，不需要添加额外的物质。在观察单纯大肠杆菌对肿瘤的生长抑制实验中，大肠杆菌在加有氨苄的培养基中，放入37℃，220转/分的摇床培养6～8小时，直至OD600达到0.6～0.8，大肠杆菌生长达到中对数期。收菌，用无菌生理盐水洗3次，离心沉淀，最后用一定体积的生理盐水重悬。所用顺铂均购自中国人民解放军307医院，所用细胞为B16黑色素瘤细胞、鼠神经胶质瘤细胞、前列腺癌细胞，所有细胞均稳定整合有荧光质粒pXen-1，购自Xenogen公司。B16黑色素瘤细胞在添加有12％的胎牛血清、1％丙酮酸钠、1％MEM维生素、1％非必需氨基酸、1％谷氨酰氨、1％双抗的DMEM培养基中生长；鼠神经胶质瘤细胞在添加有10％的胎牛血清、100单位/ml青霉素G、250ng/ml两性霉素、100单位/ml链霉素的1640培养基中生长。
1.2统计分析各实验中三组肿瘤体积之间的差异采用单因素K水平的方差分析进行检验，各实验组中肿瘤体积均以X±S表示，肿瘤组织中的顺铂含量的差异采用成组设计t检验进行分析。
1.3受体动物和肿瘤模型的建立实验所用动物为6～8周龄雄性Balb/c小鼠，所有小鼠均购自军事医学科学院实验动物中心。为了使小鼠产生B16、神经胶质瘤细胞或前列腺癌细胞皮下肿瘤，分别收三种肿瘤细胞，用无菌生理盐水洗三遍，计数后，将5×106/100μl细胞分别接种至小鼠右后腿皮下。肿瘤的生长状况用肿瘤生长曲线表示，肿瘤体积用游标卡尺进行测量，肿瘤体积计算公式为V＝L×W2/2。L代表肿瘤的长，M代表肿瘤的宽。在肿瘤接种后7～12天(前列腺癌生长需要约1个月)，当可以触摸到时，就可以进行实验。为了建立转移肿瘤模型，将5×105cfu/100μl的B16或5×106cfu/100μl MCF-7细胞尾静脉注入裸鼠体内。7～14天后，两肺的转移瘤模型建立。
2.结果转移瘤模型结果见附图6。
实施例二 用ICP-MS检测大肠杆菌富集顺铂作用1.材料同实施例一。
2.方法结果将大肠杆菌DH5α在带有氨苄的5ml LB培养基中摇至0.6～0.8，分别加入0.5mg、0.25mg、0.05mg的顺铂，孵育1h、12h、48h长期培养。将经过顺铂不同处理的大肠杆菌用1×PBS洗五遍，离心，放入60℃的烘箱里24小时，待彻底烘干后，称重，送ICP-MS检测铂的含量。长期培养是指将细菌转接入含有一定浓度顺铂的LB培养基中，放入摇床，37℃，220转/分钟培养，直至细菌OD达到1.5左右。经检测发现大肠杆菌富集的铂量随着顺铂的浓度增加而增加，孵育24小时大肠杆菌吸附了最大量的顺铂。但是浓度太大会使细菌生长停滞，并且使细菌大量死亡。经过反复实验，将顺铂加入细菌培养基使其终浓度为0.1mg/ml，孵育1小时，在此状况下，细菌吸附较大量的顺铂，又不会导致细菌大量死亡。见附图5。
实施例三 单纯细菌对肿瘤生长抑制效果观察1.材料同实施例一。
2.方法结果设立实验组1、实验组2、对照组。实验组和对照组各5只小鼠，Balb/C小鼠，雄性，6～8周龄，均购自军事医学科学院实验动物中心。将转化有pXen-1的大肠杆菌DH5α在带有氨苄的培养基中摇至0.6～0.8，中对数生长期收细菌，用无菌生理盐水清洗3次，离心，用一定体积的生理盐水重悬，将1×108cfu/100μl大肠杆菌尾静脉注入实验组荷瘤小鼠体内，小鼠接种肿瘤为B16黑色素瘤，注射时间为接种肿瘤后7天。对照组尾静脉注射100μl无菌生理盐水，实验组1每只注射一次大肠杆菌，实验组2每周注射一次大肠杆菌，连续注射一个月，绘制肿瘤的生长曲线。连续观察30天，发现多次注射大肠杆菌对肿瘤的生长有很强的抑制作用，一次注射大肠杆菌对肿瘤无抑制作用。申请人认为单纯细菌对肿瘤的抑制作用主要是由于细菌在肿瘤部位与肿瘤争夺营养导致，是否还有促进肿瘤细胞凋亡作用尚不清楚。见附图4。
实施例四 富集顺铂的大肠杆菌对肿瘤生长抑制效果观察1.材料同实施例一。
2.方法结果设立实验组1、实验组2和对照组三组。实验组和对照组各5只小鼠，Balb/C小鼠，雄性，6～8周龄，均购自军事医学科学院实验动物中心。将大肠杆菌DH5α在带有氨苄的LB培养基中摇至0.6～0.8，加入一定量的顺铂，使顺铂溶液含量为0.1mg/ml。放入摇床，37℃，220转/分，1小时后取出，用生理盐水洗三遍，离心，用一定体积的生理盐水重悬，将2×108cfu/100μl细菌尾静脉注入实验组1的荷瘤小鼠体内，每周注射一次，连续注射一个月。实验组2注射2×108cfu/100μl没有富集顺铂的大肠杆菌DH5α每周注射一次，连续注射一个月。对照组注射100μl无菌生理盐水。绘制肿瘤生长曲线。
结果发现，与连续注射未经顺铂处理过的大肠杆菌相比，注射富集了顺铂的大肠杆菌对肿瘤生长有更明显的抑制作用。见附图7。
实施例五 富集顺铂的大肠杆菌和小量顺铂对肿瘤的生长抑制作用比较1.材料同实施例一。
2.方法结果设立实验组1、实验组2、对照组。实验组和对照组各5只小鼠，Balb/C小鼠，雄性，6～8周龄，均购自军事医学科学院实验动物中心。将大肠杆菌在带有氨苄的LB培养基中摇至0.6～0.8，加入一定量的顺铂，使溶液顺铂含量为0.1mg/ml。放入摇床，37℃，220转/分钟，1小时后取出，用生理盐水洗三遍，离心，用一定体积的生理盐水重悬，将1×108cfu/100μl大肠杆菌尾静脉注入实验组1的荷瘤小鼠体内，肿瘤为B16黑色素瘤，每周注射一次，连续注射一个月。实验组2注射小剂量顺铂(10μg/天)，每周注射一次，连续注射一个月。对照组注射100μl无菌生理盐水。绘制肿瘤生长曲线。并分别将实验组1、实验组2、对照组的肿瘤取出，送ICP-MS检测铂含量。
结果显示，注射大肠杆菌组对肿瘤的生长有明显抑制作用，而注射小量的顺铂组与对照组无显著差异。由此也说明，细菌会富集高浓度的顺铂到肿瘤部位特异性发挥抗肿瘤作用。之后将三组小鼠全部处死，解剖后取出肿瘤组织及正常脏器，送ICP-MS检测铂的含量，发现注射细菌组小鼠肿瘤中铂的含量远远高于单纯注射顺铂组小鼠肿瘤中铂的含量；注射大肠杆菌组小鼠肿瘤组织中的顺铂含量远高于正常组织，而注射顺铂组小鼠肿瘤组织中顺铂含量与正常组织中顺铂含量基本相同。由此也说明富集了顺铂的细菌会将顺铂特异性带到肿瘤部位，在肿瘤局部形成高浓度的顺铂。见附图8，附图9。
实施例六 大肠杆菌肿瘤靶向性实验1.材料同实施例一2.方法结果
2.1大肠杆菌靶向原位肿瘤实验将带有LucABCDE标记的大肠杆菌DH5α 1×109cfu/100μl尾静脉注入三只预先接种有B16黑色素瘤的小鼠体内，第一只小鼠注射细菌后第二天在肿瘤部位出现荧光，另外两只在注射细菌后第三天出现荧光。三只小鼠其他部位没有荧光，荧光持续存在，一只小鼠在一个月后处死、解剖，仍发现肿瘤部位有荧光，正常组织无荧光。将1×108cfu/100μl和1×107cfu/100μl，转化有pXen-1质粒的BL21大肠杆菌注入荷B16瘤小鼠体内，分别在四天后和两天后处死、解剖，发现在肿瘤部位均有较强荧光，正常组织均无荧光。注射三个浓度的大肠杆菌均发现细菌在肿瘤中聚集，而正常组织均无细菌聚集，由此说明，大肠杆菌对肿瘤组织有很强的肿瘤靶向性，而且，细菌的肿瘤靶向性不受肿瘤大小的限制，观察到的细菌所能聚集的最小肿瘤体积是100mm2。除上面结果，本发明又对不同的大肠杆菌BL21和HB101，以及不同的肿瘤鼠神经胶质瘤细胞和前列腺癌细胞两种肿瘤，进行了相同的实验，发现不同的大肠杆菌可以在不同的肿瘤细胞聚集。见图1，2，3。
2.2大肠杆菌靶向转移肿瘤将1×108cfu/100μl转化有pXen-1质粒的大肠杆菌DH5α尾静脉注入预先已造成的肺肿瘤转移小鼠体内。4天后，活体成像观察，发现肺肿瘤部位有荧光。将小鼠处死后解剖，将肺转移肿瘤取出后活体成像，发现在肺肿瘤处有荧光，正常组织无荧光。说明细菌不仅在原发的肿瘤组织聚集，还可以在转移的肿瘤组织聚集。此外，分别检测了另外两种大肠杆菌BL21、HB101和两种肿瘤鼠神经胶质瘤细胞、前列腺癌细胞，发现不同大肠杆菌对不同种的肿瘤组织均具有定位的能力。
权利要求
1.一种抗肿瘤的药物组合物，其特征在于包含富集有顺铂的活体大肠杆菌。
2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中大肠杆菌包括大肠埃希菌属的各个种或在此基础上经过遗传工程改造的大肠杆菌工程菌。
3.根据权利要求1或3所述的药物组合物，其中大肠杆菌为DH5α、BL21、JM101、JM103～JM109、K802或K803。
4.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肿瘤为各种实体瘤。
5.根据权利要求1所述的药物组合物，其中所述肿瘤为鼠黑色素肿瘤B16-F10、人肝癌BEL7405或SMMC7721、人前列腺癌PC-3、人乳腺癌MCF-7、人纤维肉瘤细胞HT1080、鼠膀胱肉瘤细胞MB-49或鼠神经胶质瘤C6。
6.权利要求1所述药物组合物的制备方法，其特征在于组合物中富集有顺铂的活体大肠杆菌的制备包括如下步骤(1)将大肠杆菌在带有氨苄的LB培养基中培养；(2)在培养基中加入一定量的顺铂；(3)培养一定时间后，洗涤并重悬。
7.根据权利要求6所述方法，其中富集有顺铂的活体大肠杆菌的制备包括如下步骤(1)将大肠杆菌在带有氨苄的LB培养基中培养至OD600为0.6～0.8；(2)在培养基中加入一定量的顺铂，使溶液顺铂含量为0.1mg/ml；(3)37℃振荡培养1小时后取出，用生理盐水洗涤，离心并重悬。
8.权利要求1所述的药物组合物的剂型为注射剂，给药途径为静脉给药。
9.权利要求1所述的药物组合物的给药剂量为每公斤体重所需的药物组合物中含大肠杆菌5×108～1×1011cfu。
10.权利要求1或9所述的药物组合物的给药剂量为每公斤体重所需的药物组合物中含大肠杆菌5×109cfu。
全文摘要
本发明公开了一种抗肿瘤的药物组合物及其制备方法。本发明的药物组合物中含有富集有抗肿瘤物质的活体大肠杆菌，其中的抗肿瘤物质可以为化疗药物顺铂。本发明证明了大肠杆菌具有富集顺铂的能力，利用大肠杆菌的肿瘤靶向能力以及富集顺铂的能力，使大肠杆菌携带一定量的顺铂，到达肿瘤部位，特异性的发挥抗肿瘤作用，达到治疗肿瘤的目的。本发明的药物组合物，其中的大肠杆菌作为新的肿瘤靶向载体，具有安全、特异性强、副反应少等优点，使顺铂能特异性地在肿瘤组织发挥作用，避免了其毒副作用，可以用来诊断或治疗肿瘤，具有广阔的市场和应用前景。
文档编号C12N1/21GK1903223SQ200510087110
公开日2007年1月31日 申请日期2005年7月27日 优先权日2005年7月27日
发明者张学敏, 王晨辉, 张海英 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物医学分析中心