专利名称：一种抗肿瘤组合物及其制备方法和用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤药物，特别是涉及一种由三种中药材—苦参、黄芪和川芎中的抗肿瘤“有效部位群”或有效成份构成的抗肿瘤组合物以及上述组合物的制备方法及其作为治疗肿瘤病药物的应用。
首先，本发明提出的抗肿瘤组合物的活性成分是来源于一定比例(此比例参见后文描述的三种药材的比例范围)的苦参、黄芪和川芎的中药材混合物的总生物碱和总多糖(本文称之为“有效部位群”)。
其次，本发明提出的抗肿瘤组合物的活性成分是苦参、黄芪和川芎三味中药材中所含化合物氧化苦参碱、黄芪多糖和川芎嗪按照一定比例(此比例参见后文描述的三种药材的比例范围)的比例组合而成。显然，这三种化合物，不论是植物提取物还是来源于化学合成，均可用于本发明组合物的活性成分之中。
此外，本发明还提出从三味原药材中提取本发明组合物所含的有效部位群的方法，其包括两种不同的制备路线其一是将三味药材按上述比例混合后，分步骤提取其总生物碱和总多糖；其二是将上述比例的原药材分别提取活性成分，即，从苦参原药材中提取苦参总碱，从黄芪原药材中提取黄芪多糖，从川芎原药材中提取川芎总碱，然后将所得的这些成分合并成为有效部位群。
本发明的抗肿瘤组合物即是由上述活性部位群以及生理学上可接受的合适的赋形剂组成。本发明的抗肿瘤组合物所采用的剂型可以包括口服固体制剂如片剂、胶囊剂等，注射用制剂如注射用溶液、粉针剂、及冻干粉针剂等。
本发明的组合物可作为治疗原发性肺癌和预防肺癌术后复发及辅助治疗其它实体瘤的药物。
下面的详细描述将有助于更进一步理解本发明。
除另有说明外，本说明书的部分术语的定义如下苦参或其原药材，是指豆科植物苦参(Sophora flavescens Ait)的干燥根，或由豆科植物苦参干燥根制作的中药材饮片。在用于本发明时，可以将其粉碎成粗颗粒以便于提取。
黄芪或其原药材，是指豆科植物黄芪(Astragalus membranaceus[Fisch]Bge)的根茎，或由豆科植物黄芪的根茎制作的中药材饮片。在用于本发明时，可以将其粉碎成粗颗粒以便于提取。
川芎或其原药材，是指伞形科植物芎穹(Ligusticum chuanxiongHort.)的块状根，或由伞形科植物芎穹的块状根制作的中药材饮片。在用于本发明时，可以将其粉碎成粗颗粒以便于提取。
苦参总碱是指按本说明书所述方法从苦参原药材中提取获得的由苦参中含有的多种生物碱组成的总生物碱，并且，其中各种生物碱量的总和不低于总提取量的80％(w/w)。已知苦参总碱中含有氧化苦参碱(oxymatrine)、苦参碱(matrine)、异苦参碱(isomatrine)、槐果碱(sophocarpine)、槐定碱(sophoridine)、氧化槐果碱(oxysophocarpine)、N-甲基野靛碱(N-methylcytisine)、槐醇(sophoranol)等。
黄芪多糖是指按本说明书所述方法从黄芪原药材中提取获得的由黄芪中所含多糖类物质组成的总多糖，并且，其中多糖总量不低于总提取量的80％(w/w)。
川芎总碱是指按本说明书所述方法从川芎原药材中提取的由中药川芎所含多种生物碱组成的总生物碱，并且，其中各种生物碱量的总和不低于总提取量的50％(w/w)。已知川芎总碱中含川芎嗪(四甲基吡嗪)等。
有效部位群是指从按照后文描述的比例范围混合上述三味原药材中提取的总生物碱和总多糖的混合物，该混合物中生物碱类和多糖类化合物的实际含量之和不低于混合物总量的80％；也指上述从三味药材分别提取苦参总碱、黄芪多糖以及川芎总碱后再复合组成的混合物，同样，该混合物中生物碱类化合物和多糖类化合物的实际含量之和不低于混合物总量的80％；还指按照后文描述的比例范围混合的苦参和黄芪两味原药材中提取的总生物碱和总多糖，再加入相应比例的川芎嗪而形成的混合物；此外，有效部位群还包括由黄芪多糖及氧化苦参碱、川芎嗪等纯品化合物按照后文描述的比例范围组成的混合物。所有这些有效部位群的混合物中生物碱类和多糖类化合物的实际含量之和也都不低于混合物总量的80％。
本发明组合物包括上述有效部位群和生理学上可接受的赋形剂。其中，有效部位群的组成及其制备方法如下1、由来源于特定“比例范围”内的苦参、黄芪和川芎三种原药材的总生物碱和总多糖组成的有效部位群。该比例范围是指所使用的苦参、黄芪和川芎三种原药材的比例在16∶4∶1至1∶1∶1之间，优选比例在6∶3∶1至3∶1.5∶1之间，最优选的比例为4∶2∶1。该有效部位群按照如下方法制备(1)、“混合提取”或称其为“复方提取”，即，将上述比例范围内的三种原药材混合后，提取其所含的总生物碱和总多糖。
本发明提出的混合提取的方法是首先采用浓度在80％以上的乙醇对上述三种原药材的混合物进行回流提取，其提取液用于进一步分离总生物碱；乙醇回流提取后的残渣用于提取总多糖。该回流提取的条件通常为常压下在68～80℃之间回流2～3次，每次回流时间为45～90min，每次回流时所用乙醇量为原药材总量的3～5倍(w/w)。优选的回流条件是每次回流的乙醇浓度为90％，用量为原药材总量的4倍，每次回流60min，并且每批药材回流两次。
由乙醇回流液分离总生物碱的方法是回收回流液中的乙醇后，残留液于4℃下静置12小时以上，离心去沉淀，上清液中加入2～4倍量的含0.5％盐酸的水溶液后，过强酸型阳离子交换树脂，以生物碱专属性显色剂如碘化铋钾监测流出液以确认树脂柱是否饱和。水洗树脂柱至流出液近无色。碱化树脂，如适量氨水碱化，以有机溶剂如氯仿等回流提取树脂上吸附的生物碱。回流洗脱完全后，回收洗脱溶剂，即获得所需的总生物碱。或以碱化后的醇溶液如含15～25％氨水的乙醇液直接洗脱水洗后的树脂柱直至无生物碱流出，回收乙醇后，以水不溶性有机溶剂如氯仿萃取残留液。萃取液回收溶剂后即获得所需的生物碱。
从残渣中提取总多糖的方法是以5～10倍于原药材量的水加热(80～100℃)提取2～3次，每次30～60min。去残渣，合并的提取液适当浓缩或不浓缩，加入乙醇使乙醇终浓度达15～30％，静置并离心去沉淀。上清液继续加乙醇使乙醇终浓度达到约65～85％，静置并离心。取沉淀。此即粗制总多糖。采用本领域内熟知的方法(参见实施例1)对该粗制总多糖进行脱色、脱蛋白处理即获得总多糖。
合并上述总生物碱和总多糖即为“有效部位群”。
(2)、“分别提取”或称其为“单味提取”，即，本发明的三味原药材在提取前并不混合，而是分别提取各味药材的有效成分从苦参中提取苦参总碱；从黄芪中提取黄芪多糖；从川芎中提取川芎总碱。这些提取方法可见于多种专著或相关文献。将前文定义的比例范围内的各味药材中所得的苦参总碱、黄芪多糖和川芎总碱混合即获得所需的“有效部位群”。
2、由来源于特定“比例范围”内的苦参、黄芪两种原药材的总生物碱和总多糖与适量川芎嗪纯化合物组成的有效部位群。该特定“比例范围”是指所使用的苦参、黄芪两种原药材的比例在4∶1至1∶1之间，优选比例2∶1。该有效部位群中来源于苦参和黄芪两味药材的总生物碱和总多糖，可以采用类似于1(1)“混合提取”或1(2)“分别提取”中描述的方法提取，不同之处在于，此时的“混合提取”及“分别提取”的原药材中均不包括川芎。而获得这些总生物碱和总多糖后，按照川芎嗪量/提取物总量约为1∶15至1∶35的比例加入川芎嗪，由此获得“有效部位群”。对于上述川芎嗪的加入量，在“混合提取”的情况下，其川芎嗪量/提取物总量的比例优选为1∶25；在“分别提取”的情况下，其川芎嗪量/提取物总量的比例优选为1∶20。
3、由黄芪多糖与氧化苦参碱、川芎嗪纯品化合物组成的“有效部位群”。其中氧化苦参碱/黄芪多糖/川芎嗪的比例在3∶3∶1至24∶9∶1之间，并优选10∶6∶1的比例。此外，上述氧化苦参碱、川芎嗪化合物既可以来源于植物(中药材)提取，也可以来源于化学合成或半合成。
本发明还提出由上述“有效部位群”和生理学上可接受的赋形剂组成的药用组合物。这些药用组合物的剂型可以是口服固体制剂，如片剂、较囊剂等，也可以是胃肠外给药用制剂，如注射液、注射用粉针剂或注射用冻干粉针剂等。
其中，口服固体制剂可以采用每日口服一次的单位剂型，其每片(粒)中含有上述“有效部位群”50～200mg。也可以制备每片(粒)含20～100mg“有效部位群”的口服固体制剂，例如，每片(粒)含50mg“有效部位群”的制剂，而每日给药数次和/或每次给药数片(粒)，如每日2～3次，每次2～3片(粒)。优选的固体制剂是每片(粒)含“有效部位群”50～100mg，每日给药2次，每次1～2片(粒)。
鉴于本发明组合物中含有总多糖，因而优选的胃肠外给药制剂为粉针剂或冻干粉针剂。
本发明的抗肿瘤组合物可用作治疗原发性肺癌和预防肺癌术后复发及辅助治疗其它实体瘤的药物。
本发明组合物还可以与其它化疗药物联用。由于本发明化合物具有免疫调节作用，因此当本发明组合物与化疗药物联合使用时，不仅在抗肿瘤疗效上获得加和作用，而且可在一定程度上减轻其它化疗药物对免疫系统和造血系统产生的不良副作用，并可能由此改善其它化疗药物的用药周期。
实施例1混合提取法获得“有效部位群”I)、分离总生物碱 取本文定义的三种原药材，其中，苦参400g，黄芪200g，川芎100g，将这些药材粉碎成20目粗粉(参见《中国药典》2000版，一部，附录)。混合上述药材粉末，加入2800ml浓度为90％的乙醇进行回流提取，回流2遍，每次60min。合并回流液，减压回收乙醇，余约500ml残留液于4℃下静置过夜。离心去沉淀，上清液中加入2000ml含0.5％盐酸的水溶液后，过柱体积约500ml强酸型阳离子交换树脂(732型，上海化学试剂公司)。水洗树脂柱至流出液近无色。取出树脂适当晾干，15％氨水(约80ml)碱化树脂。碱化后树脂以1000ml氯仿进行索氏回流提取直至生物碱全部被洗脱。回流液以NaSO4干燥后，回收氯仿，获得浅黄色总生物碱6.8g(以原药材总量计得率约0.97％)。该总生物碱通过HPLC检定(色谱条件为固定相—BDS柱[5.0mm×25cm×10μm]；流动相—水∶甲醇＝42∶58[含0.01％三乙胺]；流速--1ml/min；柱温35℃；检测波长-220nm；进样量-20μl)，其氧化苦参碱、槐定碱、苦参碱、川芎嗪、总生物碱的含量分别为10.77％、9.50％、44.59％、0.005％、90.60％(参见附图
)。
II)、分离总多糖步骤I)中乙醇回流后的原药材残渣，加入5000ml水煎煮提取。共煎2次，每次60min。之后，去残渣，将合并浓缩至1000ml，加入乙醇使乙醇终浓度达20％，静置并离心去沉淀。上清液继续加乙醇使乙醇终浓度达到约70％，静置并离心。取沉淀。将此沉淀重新溶解于500ml水中，加入活性炭10g，搅拌30min，加入乙醇使其终浓度达到30％，离心去沉淀。上清液继续加乙醇至终浓度达70％，离心得沉淀，90％乙醇洗涤(200ml×2)，真空干燥获得近白色总多糖5.7g(以原药材总量计得率约0.81％)。以硫酸～苯酚法测得其糖含量为91％。
III)、制备“有效部位群”将步骤I)和步骤II)所得总生物碱和总多糖合并即得“有效部位群”12.5g，总得率约1.8％。其中总生物碱与总多糖的比例约为10∶8.3。
实施例2分别提取法获得“有效部位群”I)、分离苦参总碱 取苦参原药材400g粉碎成20目粗粉，以类似实施例1中步骤I)的方法分离获得苦参总碱约6.6g(得率约1.4％)。
II)、分离黄芪多糖 取黄芪原药材200g粉碎成约20目粗粒，以类似实施例1中步骤II)的方法获得黄芪多糖3.8g(得率约1.9％)。
III)、分离川芎总碱 取川芎原药材100g粉碎成20目粗粉，以400ml90％乙醇回流提取3次，每次60min，合并提取液，加入5％盐酸75ml，回收乙醇后，4℃下静置过夜。离心去沉淀，上清液以石油醚萃取(150ml×2)，水相以饱和碳酸钠碱化pH10，氯仿萃取(150ml×3)。合并的氯仿相以1％盐酸反萃(150ml×3)，再以饱和碳酸钠碱化pH10，氯仿萃取(150ml×3)。减压回收氯仿得到淡褐色川芎总碱约0.08g(得率约0.08％)。
IV)、制备“有效部位群”将步骤I)、步骤II)和步骤III)所得苦参总碱、黄芪多糖和川芎总碱糖合并即得“有效部位群”10.5g，总得率约1.5％。其中苦参总碱/黄芪多糖/川芎总碱约为10∶5.8∶0.01。
实施例3混合提取苦参和黄芪有效部位与纯品川芎嗪合并获得“有效部位群”I)、分离总生物碱 取苦参原药材400g和黄芪原药材200g粉碎成20目粗粉，以类似实施例1中步骤I)的方法分离获得总生物碱约6.6g(以生药总量计得率约1.1％)。
II)、分离总多糖 步骤I)的药材残渣以类似实施例1中步骤II)的方法获得总多糖4.9g(得率约0.8％)。
III)、制备“有效部位群”将步骤I)和步骤II)所得总碱和总多糖合并，并且加入0.66g川芎嗪即得“有效部位群”约12.2g。其中苦参总碱/黄芪多糖/川芎总碱约为10∶5.8∶1。
实施例4分别提取苦参和黄芪有效部位与纯品川芎嗪合并获得“有效部位群”取苦参原药材400g和黄芪原药材200g粉碎成20目粗粉，以实施例2中步骤I)和步骤II)的分别分离苦参总碱和黄芪多糖并，将它们合并后加入0.66g纯品川芎嗪即得“有效部位群”约11.1g。其中总碱/总多糖/川芎嗪约为10∶7.4∶1。
实施例5以氧化苦参碱、黄芪多糖及川芎嗪制备“有效部位群”将纯品化合物苦参碱、实施例2步骤II)中所得黄芪多糖与川芎嗪以10∶6∶1的比例混合即得所需的“有效部位群”。
实施例6实施例1所得“有效部位群”的抗肿瘤作用检测(1)、对S180肉瘤的作用 昆明种小鼠，前肢腋下接种S180肉瘤细胞悬液(悬液浓度0.3g/ml，接种量0.01ml/g)，接种次日起腹腔注射系列浓度的实施例1所得“有效部位群”，连续10天。末次给药后24小时剥离瘤块称重，结果如表1所示。
表1 有效部位群给要前 给药后 平均瘤重肿瘤抑给药体重[g] 体重[g] [g] 制率[％][mg/kg]0 18.5±0.417.6±0.78.3±2.350 19.1±0.318.5±0.95.0±2.739.7100 18.5±0.618.5±14 4.5±2.145.7150 18.8±0.718.7±1.83.0±1.763.8(2)、对H22荷瘤小鼠的作用 昆明种小鼠，前肢腋下接种H22瘤株细胞悬液(悬液浓度0.3g/ml，接种量0.01ml/g)，接种次日起腹腔注射系列浓度的实施例1所得“有效部位群”，连续10天。末次给药后24小时剥离瘤块称重，结果如表2所示。
表2 [n＝12，X±S]有效部位群给要前 给药后 平均瘤重 肿瘤抑给药体重[g] 体重[g] [g] 制率[％][mg/kg]020.5±1.330.8±3.02.77±1.2250 21.7±1.232.8±3.21.71±0.8638.3100 21.3±1.331.5±1.91.43±0.6548.4150 21.3±0.731.7±1.81.09±0.3760.7(3)、对Lewis荷瘤小鼠的作用 C57BL/6J小鼠，前肢腋下接种Lewis瘤株细胞悬液(悬液浓度0.3g/ml，接种量0.01ml/g)，接种次日起腹腔注射系列浓度的实施例1所得“有效部位群”，连续10天。末次给药后24小时剥离瘤块称重，结果如表3所示。
表3 [n＝12，X±S]有效部位群给要前 给药后 平均瘤重 肿瘤抑给药体重[g] 体重[g] [g] 制率[％][mg/kg]0 21.3±1.325.2±1.02.85±0.655021.3±1.524.5±1.51.93±0.7432.3
100 21.5±1.2 24.0±1.5 1.76±0.71 38.3150 21.8±1.4 24.2±1.4 1.34±0.36 53.0实施例7实施例5所得“有效部位群”的抗肿瘤作用检测对H22荷瘤小鼠的作用 昆明种小鼠，前肢腋下接种H22瘤株细胞悬液(悬液浓度0.3g/ml，接种量0.01ml/g)，接种次日起腹腔注射系列浓度的实施例5所得“有效部位群”，连续10天。末次给药后24小时剥离瘤块称重，结果如表4所示。
表4[n＝12，X±S]有效部位群给要前 给药后 平均瘤重 肿瘤抑给药体重[g] 体重[g] [g] 制率[％][mg/kg]0 20.0±0.327.7±4.02.72±1.1850 20.0±0.929.6±3.12.34±1.0213.9100 20.5±0.930.5±3.21.87±0.8331.3150 20.0±0.829.4±2.51.58±0.6142.0
权利要求
1.一种抗肿瘤组合物，其特征在于，它包括来源于苦参、黄芪和川芎三种中药材的抗肿瘤“有效部位群”，以及生理学上可接受的药用赋形剂，其中，“有效部位群”为(1)、从按一定比例混合的上述三味原药材中提取的总生物碱和总多糖的混合物；(2)、从一定比例的上述三味药材分别提取苦参总碱、黄芪多糖以及川芎总碱后再复合组成的混合物；(3)、从一定比例的苦参和黄芪两味原药材中提取的总生物碱和总多糖，此既可以是将苦参和黄芪两种药材混合后提取其所含的总生物碱和总多糖，也可以是分别提取苦参总碱和黄芪多糖，然后再加入相应比例的川芎嗪而形成的混合物；(4)、由黄芪多糖与氧化苦参碱、川芎嗪等纯品化合物按照比例组成的混合物。
2.权利要求1的组合物，其有效部位群所含生物碱类化合物和多糖类化合物的实际含量之和不低于混合物总量的80％。
3.权利要求1的组合物，其有效部位群是从苦参、黄芪及川芎三味原药材的混合物中提取的总生物碱和总多糖的混合物。
4.权利要求3的组合物，其中用于提取有效部位群的苦参、黄芪及川芎三味原药材的用量比例(w/w/w)在16∶4∶1至1∶1∶1之间。
5.如权利要求4的组合物，其中用于提取有效部位群的苦参、黄芪及川芎三味原药材的用量比例(w/w/w)在6∶3∶1至3∶1.5∶1之间。
6.权利要求5的组合物，其中用于提取有效部位群的苦参、黄芪及川芎三味原药材的用量比例(w/w/w)为4∶2∶1。
7.权利要求1的组合物，其中的有效部位群是从苦参、黄芪及川芎三味原药材中分别提取的苦参总碱、黄芪多糖和川芎总碱的混合物。
8.权利要求7的组合物，其中用于提取有效部位群的苦参、黄芪及川芎三味原药材的用量比例(w/w/w)在16∶4∶1至1∶1∶1之间。
9.权利要求8的组合物，其中用于提取有效部位群的苦参、黄芪及川芎三味原药材的用量比例(w/w/w)在6∶3∶1至3∶1.5∶1之间。
10.权利要求9的组合物，其中用于提取有效部位群的苦参、黄芪及川芎三味原药材的用量比例(w/w/w)为4∶2∶1。
11.权利要求1的组合物，其中的有效部位群是从苦参、黄芪两味原药材的混合物中提取的总生物碱和总多糖与纯品川芎嗪的混合物。
12.权利要求11的组合物，其中用于提取有效部位群的两味原药材的混合物中苦参与黄芪的比例在4∶1至1∶1之间，而加入的川芎嗪与提取物总量的比例在1∶10至1∶40之间。
13.权利要求12的组合物，其中用于提取的有效部位群的两味原药材的混合物中苦参与黄芪的比例为2∶1，而加入的川芎嗪与提取物总量的比例为1∶20。
14.权利要求1的组合物，其中的有效部位群是从苦参中提取的苦参总碱、从黄芪中提取的黄芪多糖与纯品川芎嗪的混合物。
15.权利要求14的组合物，其中用于提取有效部位群的苦参与黄芪两味原药材的用量比例在4∶1至1∶1之间，而加入的川芎嗪与提取物总量的比例在1∶10至1∶40之间。
16.权利要求15的组合物，其中用于提取的有效部位群的苦参与黄芪两味原药材的用量比例为2∶1，而加入的川芎嗪与提取物总量的比例为1∶16。
17.权利要求1的组合物，其中的有效部位群由氧化苦参碱、黄芪多糖以及川芎嗪组成。
18.权利要求17的组合物，其中的有效部位群中的氧化苦参碱/黄芪多糖/川芎嗪的比例在3∶3∶1至24∶9∶1之间。
19.权利要求18的组合物，其中的有效部位群中的氧化苦参碱/黄芪多糖/川芎嗪的比例为10∶6∶1。
20.权利要求1的组合物的制备方法，其有效部位群按如下步骤制取(1)、将三种原药材粉碎成粗粉，混合后采用浓度为80％以上的乙醇进行回流提取；(2)、回收步骤(1)所得回流液中的乙醇后，残留液于0℃～10℃下静置，离心去沉淀，上清液中加入2～4倍量的含0.1％～2％盐酸的水溶液后，过强酸型阳离子交换树脂，水洗树脂柱后再碱化树脂，以有机溶剂回流提取树脂上吸附的生物碱，或以碱化后的醇溶液直接洗脱水洗后的树脂柱，回收流出液的乙醇后，以水不溶性有机溶剂萃取，回收萃取液溶剂后即获得所需的生物碱；(3)、适量的水加热提取步骤(1)中醇回流后的药材残渣，合并的提取液中以乙醇进行分级沉淀，获得粗制总多糖，并对该粗制总多糖进行脱色、脱蛋白处理即获得总多糖；(4)、合并步骤(2)和步骤(3)所得的总生物碱和总多糖即为有效部位群。
21.权利要求1的组合物用作治疗原发性肺癌和预防肺癌术后复发及辅助治疗其它实体瘤的药物。
全文摘要
一种抗肿瘤组合物及其制备方法和用途,其组合物包括以来源于三种中药材——苦参、黄芪和川芎的生物碱和多糖,或者以上述三种中药材所含化合物——氧化苦参碱、黄芪多糖和川芎嗪组成抗肿瘤活性成分,并包括生理上可接受的药用赋形剂;其制备方法包括两种,其一是将三味药材按上述比例混合后,分步骤提取其总生物碱和总多糖;其二是将上述比例的原药材分别提取活性成分,然后将所得的这些成分合并成为有效部位群。本发明的抗肿瘤组合物可用作治疗原发性肺癌和预防肺癌术后复发及辅助治疗其它实体瘤的药物。
文档编号A61K31/715GK1362064SQ0113018
公开日2002年8月7日 申请日期2001年12月30日 优先权日2001年12月30日
发明者赵金华, 赵耘, 姚倩, 梅映昊, 李靖, 蔡培烈, 林洪生, 李树奇, 李攻戍 申请人:深圳海王药业有限公司