专利名称：一种海洋动物的抗肿瘤有效组分的制备方法
技术领域：
本发明涉及抗肿瘤有效组分的制备方法，特指一种海洋动物的抗肿瘤有效组分的制备方法。
背景技术：
肿瘤现已成为严重威胁人类生命健康且较广泛的疾病，全世界每年有新发恶性肿瘤900万人，而死于该病的达700万人。中国有13亿人口，每年大约有160万新发恶性肿瘤患者，每年大约有130万人死于癌症，因此癌症正超过心脑血管疾病而成为第一死亡原因。肿瘤的防治已成为世界范围内广泛重视的课题，世界各国每年投入了大量人力、物力进行研究，但迄今为止，对其病因及发病机理仍不十分清楚，治疗方法尚无重大突破，不少人已经开始把目光转向广阔的海洋。海洋生物有着不同于陆地生物的特殊生存环境，其中蕴藏着大量结构新颖、化学性质特殊、生物活性极其强烈的物质，在抗肿瘤方面显示了巨大的潜力。目前研究主要集中在软体动物(蒋庆锋，周有骏，王金政.海洋抗肿瘤药物研究进展.[J]中国海洋药物，2004，(06).)以及海藻类(专利CN1690076A)，抗肿瘤机理和作用效果各不相同。
石蜐Pollicipes mitella(Linnaeus，1758)又称龟足，属节肢动物门(Arthropoda)甲壳纲(Crustacea)蔓足亚纲(Cirripedia)。在《本草纲目》、《纲目拾遗》、《海南解语》中均有记载。其性平、味甘，无毒，具有补益、利尿、消积等作用，对抗肿瘤方面的研究还未展开。
发明内容
本发明的目是找到一种海洋动物具有抗肿瘤作用的有效组分的制备方法。
所述制备方法为以石蜐为原料，经药材前处理、浸膏提取、有效成分的分离等处理过程。具体为(1)药材前处理取石蜐解冻、洗净，逐一取肉，用组织捣碎匀浆机处理5-8min，滤去上清液，得前处理药材；(2)浸膏提取将前处理药材加30％-60％乙醇溶液，搅拌数分钟，超声提取30-60min，过滤，提取液备用。滤质再加30％-60％乙醇溶液，超声提取30-60min，冷浸10-12h，滤出提取液，并用30％-60％乙醇溶液洗涤残渣2-3次，合并两次提取液及洗涤液，用离心机离心3-5min，取上清液回收乙醇溶液，浓缩，得浸膏。
(3)有效成分的分离将浸膏用水稀释(7-10倍水量)后，上大孔树脂柱洗脱，上样后保留样品1-2h。依次用纯水、30％乙醇溶液、70％乙醇溶液进行洗脱，待洗脱液清澈、无气味后换用下一种洗脱液，分别收集合并各组洗脱液，浓缩，即可。
本发明优势在于1、找到了一种具有抗肿瘤作用的海洋动物目前肿瘤疾病逐渐成为对人类健康的威胁最大的疾病之一，而其尚未找到很好治疗这一疾病的方法，并在不断寻求新的物种、新的化合物来抵抗肿瘤。本发明找到了一种具有抗肿瘤作用的海洋动物——石蜐。
2、找到了这种海洋动物抗肿瘤的有效成分的制备方法经过抗肿瘤生物活性筛选试验，找到了石蜐提取物抗肿瘤活性成分的制备方法。
具体实施例方式
实施例一取石蜐解冻、洗净，逐一取肉，用组织捣碎匀浆机处理5min，滤去上清液，得前处理药材。取200g前处理药材加30％乙醇溶液300ml，搅拌1min，超声提取30min，过滤，提取液备用。滤质再加30％乙醇溶液200ml，超声提取30min，冷浸10h，滤出提取液，并用30％乙醇溶液洗涤残渣2次，合并两次提取液及洗涤液，用离心机离心3min(2500转/min)，取上清液，回收乙醇溶液，浓缩，得浸膏5g。
将5g浸膏用50ml水稀释后，上大孔树脂柱洗脱，上样后保留样品1h。先用纯水洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共400ml，浓缩至10ml，得样品A1。再用30％乙醇溶液洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共280ml，浓缩至10ml，得样品B1。再用70％乙醇溶液洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共250ml，浓缩至10ml，得样品C1。最后用无水乙醇溶液洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共250ml，浓缩至10ml，浓缩液纯清，经薄层层析点样证明无溶质故舍弃。
实施例二取石蜐解冻、洗净，逐一取肉，用组织捣碎匀浆机处理6min，滤去上清液，得前处理药材。取200g前处理药材加40％乙醇溶液300ml，搅拌1min，超声提取40min，过滤，提取液备用。滤质再加40％乙醇溶液200ml，超声提取40min，冷浸12h，滤出提取液，并用40％乙醇溶液洗涤残渣2次，合并两次提取液及洗涤液，用离心机离心5min(2500转/min)，取上清液，回收乙醇溶液，浓缩，得浸膏8g。
将8g浸膏用60ml水稀释后，上大孔树脂柱洗脱，上样后保留样品1h。先用纯水洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共450ml，浓缩至10ml，得样品A2。再用30％乙醇溶液洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共300ml，浓缩至10ml，得样品B2。再用70％乙醇溶液洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共300ml，浓缩至10ml，得样品C2。最后用无水乙醇溶液洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共300ml，浓缩至10ml，浓缩液纯清，经薄层层析点样证明无溶质故舍弃。
实施例三取石蜐解冻、洗净，逐一取肉，用组织捣碎匀浆机处理8min，滤去上清液，得前处理药材。取200g前处理药材加60％乙醇溶液300ml，搅拌1min，超声提取60min，过滤，提取液备用。滤质再加60％乙醇溶液200ml，超声提取60min，冷浸12h，滤出提取液，并用40％乙醇溶液洗涤残渣3次，合并两次提取液及洗涤液，用离心机离心5min(2500转/min)，取上清液，回收乙醇溶液，浓缩，得浸膏6g。
将6g浸膏用60ml水稀释后，上大孔树脂柱洗脱，上样后保留样品1h。先用纯水洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共450ml，浓缩至10ml，得样品A3。再用30％乙醇溶液洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共300ml，浓缩至10ml，得样品B3。再用70％乙醇溶液洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共300ml，浓缩至10ml，得样品C3。最后用无水乙醇溶液洗脱，洗脱至洗脱液清澈、无气味，收集洗脱液共300ml，浓缩至10ml，浓缩液纯清，经薄层层析点样证明无溶质故舍弃。
实施例四抗肿瘤生物活性筛选试验1、筛选方法四氮唑盐(microculture tetrozolium，MTT)还原法2、操作步骤(1)96孔板每孔加入单细胞悬液90μl。空白组只加完全培养基，不含细胞悬液。细胞接种后，于37℃、5％CO2培养箱培养24h。
(2)将阳性药物(甲氨喋呤)与待测化合物各配成5个浓度梯度(5倍稀释)，每孔加10μl，每个浓度设四个平行；阴性对照组加生理盐水。连续培养48h。然后每孔加入20μl的5mg/ml MTT溶液(Sigma，生理盐水配制)，继续培养4h。
(3)每孔加入50μl的三联液(10％SDS-5％异丁醇-0.1％HCl)，37℃培养箱中过夜。
(4)于570nm处用酶标仪测定OD值。
(5)按照下式计算抑制率，求IC50。
3、样品与细胞株试药甲氨喋呤，样品A1、A2、A3(纯水洗脱得到的样品)、样品B1、B2、B3(30％醇洗脱得到的样品)、样品C1、C2、C3(70％醇洗脱得到的样品)。
细胞株人白血病细胞株CCRF-CEM，肺癌细胞株A549。
4、试验结果
对照品甲氨喋呤对人白血病细胞株CCRF-CEM和肺癌细胞株A549的IC50分别为0.41μg/ml和0.29μg/ml5、结论在三种实施例中，石蜐提取物C1、C2、C3组分的IC50都分别优于A和B组分，且实施例二所得到的浸膏最多，C2组分对人白血病细胞株CCRF-CEM和人肺癌细胞株A549的生长抑制活性也最高。
权利要求
1.一种海洋动物的抗肿瘤有效组分的制备方法，其特征是以石蚴为原料，经药材前处理、浸膏提取、有效成分的分离的处理过程而制备得到抗肿瘤有效组分。
2.根据权利要求1所述的一种海洋动物的抗肿瘤有效组分的制备方法，其特征是(1)药材前处理取石蚴解冻、洗净，逐一取肉，用组织捣碎匀浆机处理5-8min，滤去上清液，得前处理药材；(2)浸膏提取将前处理药材加30％-60％乙醇溶液，搅拌，超声提取30-60min，过滤，提取液备用；过滤后得到的物质再加30％-60％乙醇溶液，超声提取30-60min，冷浸10-12h，滤出提取液，并用30％-60％乙醇溶液洗涤残渣2-3次，合并两次提取液及洗涤液，用离心机离心3-5min，取上清液回收乙醇溶液，浓缩，得浸膏；(3)有效成分的分离将浸膏用水稀释7-10倍后，上大孔树脂柱洗脱，上样后保留样品1-2h；依次用纯水、30％乙醇溶液、70％乙醇溶液进行洗脱，待洗脱液清澈、无气味后换用下一种洗脱液，分别收集合并各组洗脱液，浓缩，即可。
全文摘要
本发明为一种海洋动物的抗肿瘤有效组分的制备方法。其以石蚴为原料，经药材前处理、浸膏提取、有效成分的分离等过程制备而成。其将前处理药材加30％－60％乙醇溶液，搅拌数分钟，超声提取30－60min，过滤，滤质再加30％－60％乙醇溶液，超声提取30－60min，冷浸10－12h，滤出提取液，并用30％－60％乙醇溶液洗涤残渣2－3次，合并两次提取液及洗涤液，用离心机离心3－5min，取上清液回收乙醇溶液，浓缩，得浸膏。再将浸膏用水稀释，上大孔树脂柱洗脱，上样后保留样品1－2h，进行洗脱浓缩。本发明经过抗肿瘤生物活性筛选试验，证明其对抗肿瘤具有明显疗效。
文档编号A61P35/00GK101062062SQ200710022469
公开日2007年10月31日 申请日期2007年5月21日 优先权日2007年5月21日
发明者张朝晖, 唐清泉, 李晓波 申请人:江苏大学