一种活体肿瘤组织库的建立方法及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一种活体肿瘤组织库的建立方法及其应用，通过将人体癌症患者手术后的肿瘤组织移植到SCID小鼠的肾脏被膜下，在小鼠体内存活并传代保存，得到活体肿瘤组织库，活体肿瘤组织库是在单一的肿瘤组织异种移植基础上，将众多的人体肿瘤组织以活体组织库的形式在动物体内保存、备用。该活体肿瘤组织库包括横向的多种肿瘤，也包括纵向的某种肿瘤的各种亚型或者各种发展阶段。该活体肿瘤组织库具有多种用途，包括在确定癌症患者手术后个性化治疗方案方面的应用，在抗癌药物的肿瘤特异性筛选方面的应用，以及在构建人体癌症研究的动物模型方面的应用。
【专利说明】一种活体肿瘤组织库的建立方法及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于癌症治疗【技术领域】，尤其涉及一种活体肿瘤组织库的建立方法及其应用。
【背景技术】
[0002]癌症对人类的危害日趋严重，平均每四位死亡病人中至少有一位死于癌症。目前对于癌症治疗的被动消极状态主要归因于两个方面:一是癌症本身的复杂性与高度的应变性(包括对治疗药物的抗药性);二是治疗措施的单一性(无特异性及定向性)与不可变性。一个理想的治疗措施应该专一性地作用于肿瘤组织，达到以多对杂、以可变对多变，使癌症与治疗这一个矛盾的组合体在人体个性、肿瘤特性、细胞乃至分子特性各个层次上有机结合。癌症与治疗措施的动态监测是达到上述目的不可缺或的前提条件。
[0003]癌症工作者早已认识到肿瘤组织库的重要性，在世界范围内建立了(或者正在建立)各种规模、多种类型的人体肿瘤组织库。肿瘤组织库作为宝贵的资源对癌症的研究至关重要。但是，从这种传统的组织库得到的信息是肿瘤组织中已经存在的、而且是静态的，不可能获得与治疗方案有机结合的动态信息。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于提供一种活体肿瘤组织库的建立方法及其应用，旨在解决传统的组织库不能获得与治疗方案有机结合的动态信息，为探索具有实际意义的有效治疗途径提供强有力的实验平台。
[0005]本发明是这样实现的，一种活体肿瘤组织库的建立方法，包括以下步骤:`[0006]( I)将切取到的目的肿瘤组织预处理；
[0007](2)将所述肿瘤组织移植至小鼠肾脏被膜下；
[0008](3)待肿瘤生长到预定大小后，处死小鼠，在无菌条件下暴露肿瘤，获取影像资料后切取肿瘤组织，将小鼠身上获取的部分肿瘤组织分为两组，其中一组进行冰冻保存；
[0009](4)将另一组肿瘤组织重复步骤(1)和(2)进行活体组织传代，得到活体肿瘤组织库；或者将所述冰冻保存的肿瘤组织复苏后重复步骤(1)和(2)进行活体组织传代，得到活体肿瘤组织库。
[0010]优选地，在步骤(1)中，所述肿瘤组织预处理包括:将手术切除的人体肿瘤组织立即放在无菌、低温保存液中，去除可辨认的坏死组织；将肿瘤生长旺盛部位切成1X1X3_的组织块。
[0011]优选地，所述人体肿瘤为任何人体实体恶性肿瘤，包括肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌、皮肤癌、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤。
[0012]优选地，在步骤(2)中，所述小鼠为鼠龄4~5周的SCID小鼠。
[0013]优选地，在步骤(2)中，所述移植包括:将小鼠在常规消毒、麻醉条件下暴露左侧肾脏，于肾嵴上端用注射针头挑起肾被膜，剪一个小口，然后用小玻璃棒剥离肾被膜至肾嵴下端，用小镊子将肿瘤块放于低端与上端各一块；最后将肾脏复位、分别缝合肌肉与皮肤、常规复苏与护理。
[0014]优选地，在步骤(3)中，所述冰冻保存包括:将肿瘤组织放在含有1%DMS0的保存液中，以每分钟降低I度的速度降至_80°C，3小时后转移到液氮内保存。
[0015]优选地，在步骤(4)中，所述肿瘤组织复苏包括:将冰冻保存的肿瘤组织置于37°C水浴中复苏。
[0016]本发明进一步提供了上述活体肿瘤组织库在确定癌症患者手术后个性化治疗方案方面的应用。
[0017]本发明进一步提供了上述活体肿瘤组织库在抗癌药物的肿瘤特异性筛选方面的应用。
[0018]本发明进一步提供了上述活体肿瘤组织库在构建人体癌症研究的动物模型方面的应用。
[0019]本发明克服现有技术的不足，提供一种活体肿瘤组织库的建立方法及其应用，通过将人体癌症患者手术后的肿瘤组织移植到SCID小鼠(Severe combinedimmunodeficient mice)的肾脏被膜下,在小鼠体内存活并传代保存,得到活体肿瘤组织库，活体肿瘤组织库是在单一的肿瘤组织异种移植基础上，将众多的人体肿瘤组织以活体组织库(Living tissue bank)的形式在动物体内保存、备用。该活体肿瘤组织库包括横向的多种肿瘤，也包括纵向的某种肿瘤的各种亚型或者各种发展阶段。该活体肿瘤组织库具有多种用途，包括在确定癌症患者手术后个性化治疗方案方面的应用，在抗癌药物的肿瘤特异性筛选方面的应用，以及在构建人体癌症研究的动物模型方面的应用。
【专利附图】
【附图说明】`
[0020]图1是本发明对比实施例中小鼠肾被膜和皮下肿瘤组织生长状况实物图；
[0021]图2是本发明用途实施例1中活体肿瘤组织库用于确定癌症患者手术后治疗的个性化方案的技术路线示意图；
[0022]图3是本发明用途实施例2中活体肿瘤组织库用于抗癌药物的肿瘤特异性筛选的技术路线不意图；
[0023]图4是本发明用途实施例3中活体肿瘤组织库用于构建人体癌症研究的动物模型的技术路线示意图。
【具体实施方式】
[0024]为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0025]实施例1
[0026]1、活体肿瘤组织库的建立及相关技术
[0027]动物选择:SCID小鼠(Severe combined immunodeficient mice),性别不限，鼠龄
4~5周。[0028]2、肿瘤选择:任何人体实体恶性肿瘤，包括肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌、皮肤癌、甲状腺癌、膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤等等。
[0029]3、数据库档案建立:包括(I)病人的一般病情资料；(2)肿瘤特殊检查资料；(3)肿瘤组织库相关资料。
[0030]4、活体肿瘤组织库的建立:
[0031](I)组织处理:将手术切除的肿瘤组织立即放在无菌、低温保存液中，在生物净化台内修剪、去除可辨认的坏死组织。将肿瘤生长旺盛部位切成IX IX 3_的组织块，视组织的大小取4~6块组织用于移植、3~4块组织冰冻保存。本过程在冰表面、无菌操作，应该在30~60分钟内完成。
[0032](2)组织移植:将小鼠在常规消毒、麻醉条件下暴露左侧肾脏，于肾嵴上端用注射针头挑起肾被膜、剪一个小口，然后用小玻璃棒剥离肾被膜至肾嵴下端，用小镊子将肿瘤块放于低端与上端各一块。最后将肾脏复位、分别缝合肌肉与皮肤、常规复苏与护理。将首次移植确定为O代。
[0033](3)组织传代:待肿瘤生长到体外可见或者可触摸时，常规处死动物、在无菌条件下暴露肿瘤，获取影像资料后切除肿瘤，然后按照上述步骤(1)和(2)重新进行组织移植，得到活体肿瘤组织库。组织传代的次数视后续需要而定，将I代组织(6~12块)作为组织库保存。
[0034](4)组织保存:将组织块放在含有1%DMS0的保存液中，以每分钟降低I度的速度降至-80°C，3小时后转移到液氮内保存。
[0035](5)组织复苏:将保存的I代组织置于37°C水浴中复苏，常规清洗后按照上述方法
(I)和(2)进行移植，得到活体肿瘤组织库。
[0036]对比实施例
[0037]该对比实施例的各个步骤与实施例1中的步骤均相同，不同之处在于，本实施例是将肿瘤块移植到小鼠的皮下。比较实施例1与对比实施例中肿瘤大小，如图1所示，其中，图a为初始脑胶质瘤组织块，图b-Ι为实施例1中培养50天后小鼠肾被膜下肿瘤组织，图b-2为对比实施例中培养40天后小鼠皮下肿瘤组织。由图1可以看出，将同样大小的脑胶质瘤组织分别移植到小鼠的皮下和肾脏被膜下，40天后发现肾脏被膜下移植的肿瘤明显大于皮下移植的肿瘤。
[0038]用途实施例1
[0039]实施例1所建立的活体肿瘤组织库用于确定癌症患者手术后治疗的个性化方案，如图2所示，由图2可知，将某癌症患者手术后的肿瘤组织移植到SCID小鼠肾被膜下，按图1中A、B、C等不同方案治疗，观察不同治疗方案对肿瘤生长抑制、杀伤及预后等效果，从而确定C为最佳个性化治疗方案。
[0040]用途实施例2
[0041]实施例1所建 立的活体肿瘤组织库用于抗癌药物的肿瘤特异性筛选，如图3所示，由图3可知，将不同种类癌症的肿瘤组织移植到同一只SCID小鼠肾被膜下，可以保证所有实验对象在完全一致的条件下进行监测。如图3所示，接受被监测的肿瘤药物治疗后，鼻咽癌(?)与脑胶质瘤(_)继续生长变大，肺癌(響)没有明显变化，而肝癌(.)则明显变小或者消失，说明该肿瘤药物最适合用于肝癌的治疗。
[0042]用途实施例3
[0043]实施例1所建立的活体肿瘤组织库用于构建人体癌症研究的动物模型，如图4所示，由图4可知，为了更好模拟癌症在人体内生长、转移侵袭情况，将不同来源的人体肿瘤组织进行原位种植，图中将活体肿瘤组织库中的肝癌(.)肺癌(響)和脑胶质瘤(_)组织分别移植到肝脏、肺脏和脑内，建立相应的原位癌动物模型。原位癌动物模型可用于癌症发生、发展以及癌症转移机制的研究，也可以用于抗肿瘤药物以及特殊治疗途径研发方面的实验研究。
[0044]相比与现有技术的缺点和不足，本发明具有以下有益效果:本发明的活体肿瘤组织库易于构建，肿瘤传代生长保留情况良好，效果突出；本发明的活体肿瘤组织库具有多种用途，包括在确定癌症患者手术后个性化治疗方案方面的应用，在抗癌药物的肿瘤特异性筛选方面的应用，以及在构建人体癌症研究的动物模型方面的应用。
[0045]以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、 等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种活体肿瘤组织库的建立方法，其特征在于包括以下步骤: (1)将切取到的目的肿瘤组织预处理； (2)将所述肿瘤组织移植至小鼠肾脏被膜下； (3)待肿瘤生长到预定大小后，处死小鼠，在无菌条件下暴露肿瘤，获取影像资料后切取肿瘤组织，将小鼠身上获取的部分肿瘤组织分为两组，其中一组进行冰冻保存； (4)将另一组肿瘤组织重复步骤(1)和(2)进行活体组织传代，得到活体肿瘤组织库；或者将所述冰冻保存的肿瘤组织复苏后重复步骤(1)和(2)进行活体组织传代，得到活体肿瘤组织库。
2.如权利要求1所述的活体肿瘤组织库的建立方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述肿瘤组织预处理包括:将手术切除的人体肿瘤组织立即放在无菌、低温保存液中，去除可辨认的坏死组织；将肿瘤生长旺盛部位切成I X I X 3mm的组织块。
3.如权利要求2所述的活体肿瘤组织库的建立方法，其特征在于，所述人体肿瘤为任何人体实体恶性肿瘤，包括肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、鼻咽癌、胰腺癌、结肠癌、膀胱癌、肾癌、皮肤癌、甲状腺癌、膀胱 癌、乳腺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、恶性胶质瘤、骨肉瘤。
4.如权利要求3所述的活体肿瘤组织库的建立方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述小鼠为鼠龄4~5周的SCID小鼠。
5.如权利要求4所述的活体肿瘤组织库的建立方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述移植包括:将小鼠在常规消毒、麻醉条件下暴露左侧肾脏，于肾嵴上端用注射针头挑起肾被膜，剪一个小口，然后用小玻璃棒剥离肾被膜至肾嵴下端，用小镊子将肿瘤块放于低端与上端各一块；最后将肾脏复位、分别缝合肌肉与皮肤、常规复苏与护理。
6.如权利要求5所述的活体肿瘤组织库的建立方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述冰冻保存包括:将肿瘤组织放在含有1%DMS0的保存液中，以每分钟降低I度的速度降至-80°C，3小时后转移到液氮内保存。
7.如权利要求6所述的活体肿瘤组织库的建立方法，其特征在于，在步骤(4)中，所述肿瘤组织复苏包括:将冰冻保存的肿瘤组织置于37°C水浴中复苏。
8.权利要求1至7任一项所述的活体肿瘤组织库在确定癌症患者手术后个性化治疗方案方面的应用。
9.权利要求1至7任一项所述的活体肿瘤组织库在抗癌药物的肿瘤特异性筛选方面的应用。
10.权利要求1至7任一项所述的活体肿瘤组织库在构建人体癌症研究的动物模型方面的应用。
【文档编号】A61B19/00GK103815973SQ201410083459
【公开日】2014年5月28日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】罗杰, 汤祥军, 戴龙君, 张永, 张力, 郭新荣, 黄宽明, 邹丹丹, 曹刚, 鲁军体, 杨明环, 王娜, 武高 申请人:湖北医药学院附属太和医院