专利名称：选育兼抗白粉病,条锈病和黄矮病小麦种质的方法
技术领域：
本发明涉及一种选育聚合多基因的兼抗白粉病，条锈病和黄矮病小麦种质的方法。
背景技术：
近年来，由于耕作制度、肥水条件与气候条件的改变以及小麦品种抗源单一化等原因，一个麦区常遭受2种以上病虫害的侵扰。白粉病和条锈病已成为我国小麦稳产、高产的主要病害。黄矮病由于传播其病原(大麦黄矮病毒)的麦蚜严重发生，有从甘肃、山西、陕西等主发区向江淮和西南麦区蔓延扩散的趋势。因此，创造兼抗白粉、条锈和黄矮病小麦新种质对于小麦的稳产高产和持续发展具有重要意义。
陈孝等曾选育了一个兼抗白粉、黄矮和三锈的小麦新种质YW243(谢皓，陈孝，张增艳，辛志勇，林志珊，杜丽璞，马有志，徐惠君.抗黄矮病小麦新品系YW243的选育和细胞分子生物学鉴定.作物学报，2000，26(6)687-691)。YW243是由Y90136与RW1685的杂交F2代材料花药培养而得到的，其中Y90136的组合为PP9-1/陕7859//丰抗8号；RW1685的组合为3*丰抗13/Khapli，PP9-1组合为CSph×2/L1//CSN5BT5D/3/Zhong 7902/4/Shan7859。从系谱推断，白粉病抗性由源自Khapli的抗白粉病基因Pm4a控制，黄矮病抗性由源于易位的中间偃麦草7X染色体上的抗黄矮病基因Bdv2控制(Zhang Z Y，Xu J S，Xu Q J，Larkin Philip，Xin Z Y.Development of novel PCR markers linked to the BYDV resistance gene Bdv2 usefulin wheat for marker-assisted selection.Theoretical and Applied Genetics，2004，109433-439)。谢皓等(谢皓，牛永春，陈孝，马有志，吴立人，林志珊.小麦新品系YW243抗条锈性鉴定和遗传分析.植物病理学报，2003，33(3)234-247)进行基因推导和与已知基因系测交的结果表明，YW243对条锈病抗性与已知基因系抗病谱不同，可能为新的抗性基因或基因组合。它对条中31号小种的抗性表现为显性单基因遗传。刘朝辉等把YW243对条中31号小种的抗性基因(暂命名为YrX)定位在2BL上，筛选出与其连锁的SSR标记Xgwm501等(刘朝辉，林志珊，陈孝，马有志，徐世昌，张增艳，辛志勇，王辉.小麦新种质YW243抗条锈病的染色体定位，麦类作物学报，2005，25(1)13-16)。
由于小麦白粉病菌(Blumeria gramini f.sp.tritici)和小麦条锈病菌(Puccinia striiformis f.sp.tritici)群体大，生理小种变异快、易造成原抗性品种丧失抗病性。若一个品种聚合了多个抗病基因，不仅可以识别多个不同的病原菌生理小种、扩大了抗病谱，而且病原菌多个无毒基因必须均发生突变(概率非常低)，才会引起品种的抗性丧失(Singh S，Sidhu JS，Huang N，Vikal Y，Li Z，Brar D S.Pyramiding Three Bacterial Blight Resistance Genes[xa5，Xa13，Xa21]UsingMarker-assisted Selection into indica Rice Cultivar PR106.Theoretical andApplied Genetics，2001，1021011-1015；Li Z K，Sanche Z A，Angeles E，SinghS，Domingo J，Huang N.Are the Dominant and Recessive Plant Disease ResistanceGene Similar？A Case Study of Rice R Genes and Xanthomonas oryza pv.Oryzaeraces.Genetics，2001，159757-765)。因此，抗病基因聚合是提高品种抗性持久性、扩大抗病谱和地区适应性的重要策略。通过有目的地杂交、复交，可以将多个抗病基因聚合到同一个体中，但要将这些基因在后代中传递，育成稳定的高代品系或品种，必须有快捷准确、切实可行的鉴定手段对每代材料进行跟踪检测。对于表型不同的抗病基因，可以通过不同病原菌的接种与表型鉴定加以区别。对于同一病害的不同基因聚合体及其后代，传统的表型鉴定难以准确鉴别其中抗病基因的个数和具体归属。分小种人工接种鉴定，可根据抗谱推导所含抗病基因的组成。但是病原分小种接种鉴定所要求的条件和经验都相当高，而且分离世代早期还受同一单株难以同时用多个小种接种鉴定的限制。
因为白粉病菌生理小种的变异，抗白粉病基因Pm4a基因对白粉病抗性日渐减弱，对目前流行的白粉病菌小种苗期抗性较好，成株期抗性已渐丧失。而源自高大山羊草染色体3S长臂、被引渗到小麦染色体3D、3B长臂上的抗白粉病基因Pm13，对目前流行的白粉病菌小种全生育期高抗；源自簇毛麦染色体6VS的抗白粉病基因PmV和Pm21，对白粉病菌的抗谱广，全生育期免疫。PmV与Pm21分别来源于苏联的和英国的簇毛麦。
含有PmV的小麦/簇毛麦6DL/6VS易位系Pm97033、Pm97034、pm97035由中国农科院作物科学所陈孝等选育而成(Li H，Chen X，Xin Z Y，Ma Y Z，Chen X Y，JiaX.Development and Identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL.6VSChromosome Translocation Lines Conferring Resistance to Powdery mildew.PlantBreeding，2005，124203-205)，含有Pm21的小麦/簇毛麦6AL/6AS易位系92R137、92R149、92R178为由南京农业大学陈佩度教授、刘大钧院士等选育而成(Chen P D，Qi L L，Zhou B，Zhang S Z，Liu D J.Development and molecular cytogeneticanalysis of wheat-Haynaldia villosa 6VS/6AL translocation lines specifyingresistance to powdery mildew.Theoretical and Applied Genetics，1995，91(6)1125-1128)。PmV与Pm21均位于簇毛麦染色体6V短臂上，由于6VS与小麦部分同源染色体难以重组、交换，所以Pm21的PCR标记也可用于检测PmV。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种选育兼抗白粉病，条锈病和黄矮病小麦种质的方法。
本发明所提供的选育兼抗白粉病，条锈病和黄矮病小麦种质的方法，是利用Pm4a的STS标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因Pm4a，利用Pm13的SCAR标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因Pm13，利用Pm21的SCAR标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因PmV，利用Bdv2的SCAR标记检测待测小麦中有无抗黄矮病基因Bdv2，利用YrX的SSR标记检测待测小麦中有无抗条锈病基因YrX。
其中，所述利用Pm4a的STS标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因Pm4a的方法如下以待测小麦的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测小麦得到470bp的DNA片段，则该待测小麦中含有抗白粉病基因Pm4a。
所述利用Pm13的SCAR标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因Pm13的方法如下以待测小麦的基因组DNA为模板，用由序列表中序列3的核苷酸序列和序列4的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测小麦得到564bp的DNA片段，则该待测小麦中含有抗白粉病基因Pm13。
所述利用Pm21的SCAR标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因PmV的方法如下以待测小麦的基因组DNA为模板，用由序列表中序列5的核苷酸序列和序列6的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测小麦得到1400bp的DNA片段，则该待测小麦中含有抗白粉病基因PmV。
所述利用Bdv2的SCAR检测待测小麦中有无抗黄矮病基因Bdv2的方法如下以待测小麦的基因组DNA为模板，用由序列表中序列7的核苷酸序列和序列8的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测小麦得到450bp的DNA片段，则该待测小麦中含有抗黄矮病基因Bdv2。
所述利用YrX-SSR检测待测小麦中有无抗条锈病基因YrX的方法如下以待测小麦的基因组DNA为模板，用由序列表中序列9的核苷酸序列和序列10的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测小麦扩增到160-180bp的DNA片段，则该待测小麦中含有抗条锈病基因YrX。
本发明利用抗白粉病基因Pm4a、Pm13、PmV，抗条锈病基因YrX、抗黄矮病基因Bdv2特异的PCR标记，检测了抗白粉病、抗条锈病、抗黄矮病5个基因的聚合体，选育出聚合Pm4a+Pm13+PmV+YrX+Bdv2五个抗病基因的兼抗白粉、条锈、黄矮病冬性材料1株，Pm4a+PmV+YrX+Bdv2四个抗病基因的冬性小麦6株，春性BC2F3材料18株，Pm4a+Pm13+YrX+Bdv2四个抗病基因的兼抗上述三种病害的冬性材料2株，春性BC2F3材料3株，具Pm13+YrX+Bdv2，PmV+YrX+Bdv2兼抗三种病害的春性BC2F3单株分别为7株与46株，可为培育持久、广谱抗性品种提供遗传基础明确的丰富抗源。本发明的方法可在无发病的环境条件、植株的任一生育期进行分子检测和快速选择，特别是在多个抗病基因聚合体检测，缩短育种周期，加快育种速度上，更体现其优越性。因此，本发明的分子标记快速选育兼抗白粉病，条锈病和黄矮病小麦种质的方法，为选育既抗白粉病，条锈病又抗黄矮病的多个基因聚合的小麦种质提供了一种快捷的选择方法。
图1为YrX-SSR引物gwm501扩增BC2F2单株结果图2为Pm4a-STS标记检测BC2F3部分单株结果图3为Pm13-SCAR标记检测BC2F3部分单株结果图4为PmV-SCAR标记检测BC2F3部分单株结果图5为Bdv2-SCAR标记检测BC2F3部分单株结果图6为YrX-SSR引物gwm501扩增BC2F3单株结果具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。
实施例1、利用5个抗病基因的分子标记，包括Pm4a-STS，Pm13-SCAR，Pm21-SCAR，Bdv2-SCAR和YrX-SSR，快速、辅助选育兼抗白粉病，条锈病和黄矮病小麦种质。
一、测试材料的获得1、田间兼抗白粉病、条锈病、黄矮病的春性小麦种质04P161～04P170(BC2F2)及其自交系BC2F3获得04P161～04P170为3×M269/GP22-15，BC2F2材料，是以春性抗黄矮病小麦品系M269为母本，兼抗白粉病、条锈病的GP22-15(携带Pm4a、Pm13、PmV、YrX)为父本杂交获得F1，再以M269为父本与F1回交得到BC1代，又以M269(携带Bdv2)为父本与BC1回交得到BC2代植株，自交1次即获得BC2F2材料04P161～04P170，再次自交即获得BC2F3材料。04P161的自交单株记为04P161-1～04P161-10，依此类推，苗期抗病性鉴定从中得到苗期抗病的04P161-1～04P170-10共95株，如表3。而M269为2×宁春12/PP9-1、F6代，PP9-1为携带Bdv2的抗黄矮病小麦材料，组合为CSph×2/L1//CSN5BT5D/3/中7902/4/中8601。GP22-15为YW243/70283(携带Pm13)//Pm97033(携带PmV)、F3的高抗白粉病、条锈病小麦材料。YW243由Y90136(做母本)与RW1685(做父本)杂交获F2代材料的花药培养的后代选育而得兼抗黄矮、白粉病、3锈的种质，其中Y90136组合为PP9-1/陕7859//丰抗8号，即PP9-1(做母本)与陕7859(做父本)得到杂交种F1再与丰抗8号(做父本)杂交获得；RW1685的组合为3×丰抗13/Khapli(含有Pm4a，)，以丰抗13做母本，携带Pm4a的Khapli为父本，杂交获得F1，再与丰抗13(做父本)回交2次获得。
其中，CSph为小麦品种中国春的ph隐性突变体、不能抑制同源染色体配对(英国剑桥植物育种研究所)；L1为抗黄矮病小麦-中间偃麦草二体附加系(Cauderon Y，Saigne B，Dauge M.1973.The resistance to wheat rusts of Agropyron INtermediumand its use in wheat improvement.InProc.4th Int.Wheat Genet.Symp.，pp.401-407.University of Missouri，Columbia，Mo)；CSN5BT5D(英国剑桥植物育种研究所)为小麦品种中国春的5B缺体5D四体、不能抑制同源染色体配对；中7902与中8601(中国农科院作物育种栽培研究所)；70283为抗白粉病小麦材料，组合为VPM/百农3217×3；Pm97033为携带PmV的抗白粉病小麦-簇毛麦易位系，由中国农科院作物育种栽培研究所育成(Li H，Chen X，Xin Z Y，Ma Y Z，Chen X Y，Jia X.Development and Identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL.6VSChromosome Translocation Lines Conferring Resistance to Powdery mildew.PlantBreeding，2005，124203-205)；宁春12为宁夏银川市科委育成的春小麦品种、丰产、广适；陕7859(陕西农科院粮食作物研究所)，是抗条锈病小麦品种；丰抗8号(中国农科院作物育种栽培研究所)，组合为有芒红7号/洛夫林10号，是抗条锈病的丰产小麦品种；丰抗13(中国农科院作物育种栽培研究所)，组合为北京14/抗引655，是抗条锈病的丰产小麦品种；Khapli为携带Pm4a的抗白粉病小麦种质(英国剑桥植物育种研究所))。
2、田间兼抗白粉病、条锈病、黄矮病的冬性小麦种质04S003-1～04S003-10的获得04S003-1～04S003-10为2×M269/GP22-13//CA9722×4(BC3F1)，是以春性抗黄矮病小麦品系M269为母本，兼抗白粉病、条锈病的GP22-13为父本杂交获得F1，再以M269为父本与F1回交得到BC1代，又与冬小麦CA9722(做父本)杂交1次，回交3次的材料。其中，GP22-13组合为YW243/70283(携带Pm13)//Pm97033(携带PmV)、F3。CA9722(中国农科院作物育种栽培研究所)是抗条锈、叶锈小麦品种。
3、含有Pm4a的Khapli，含Pm4a、抗条锈病新基因YrX的YW243(谢皓，陈孝，张增艳，辛志勇，林志珊，杜丽璞，马有志，徐惠君.抗黄矮病小麦新品系YW243的选育和细胞分子生物学鉴定.作物学报，2000，26(6)687-691)、含有Pm13的70823(即Pm776-1)、含有PmV的Pm97033(Li H，Chen X，Xin Z Y，Ma Y Z，Chen X Y，JiaX.Development and Identification of wheat-Haynaldia villosa T6DL.6VSChromosome Translocation Lines Conferring Resistance to Powdery mildew.PlantBreeding，2005，124203-205)、含有Bdv2的HW642(Zhang Z Y，Xu J S，Xu QJ，Larkin Philip，Xin Z Y.Development of novel PCR markers linked to theBYDV resistance gene Bdv2 useful in wheat for marker-assisted selection.Theoretical and Applied Genetics，2004，109433-439))分别作为各基因检测的阳性对照，小麦品种中国春(CS)、中8601、CA9722作为阴性对照。
二、抗病鉴定白粉病抗病性鉴定在田间和温室条件下，对上述测试材料幼苗先人工接种白粉病菌15号生理小种，14天后再接种白粉病自然发病的混合小种，2-3周后，感病对照中8601充分发病时，调查04P161～04P170(BC2F2)及其自交株系(BC2F3)和04S003-1～04S003-10苗期和成株期抗病性。本研究以接种叶片无白粉病菌孢子粉堆的定为抗病，叶片5％以上有白粉病菌孢子粉堆的定为感病。
黄矮病抗病性鉴定在田间苗期接种携带大麦黄矮病毒蚜虫(GAV株系)，40天后观察发病情况。以无黄矮病症叶片的植株为抗病，有黄矮病症叶片的植株为感病。
条锈病抗病性鉴定用摩擦法于一叶一心期接种条锈病菌30号流行小种，待对照品种铭贤169发病充分后(约15天)调查抗病性。以叶片无条锈病菌明显孢子堆的植株为抗病。
在田间，对转育的2个组合的春性材料与冬性材料进行抗性鉴定，结果表明，春性04P161～04P170(BC2F2)与冬性04S003-1～04S003-10各10个单株均抗白粉病、条锈病、黄矮病。对上述材料按照步骤三的方法进行分子标记检测，结果见表1、表2。并对04P161～04P170自交(BC2F3)株系04P161-1～04P170-21进行抗病鉴定及其抗性基因的分子检测。
在温室条件下，对春性材料04P161～04P170自交株系(BC2F3)04P161-1～04P170-21接种白粉病菌，鉴定其苗期、成株期的白粉病抗性，拔除苗期感病植株，保存抗病植株，继续进行成株期抗病鉴定，提取04P161-1～04P170-10共95个单株DNA，进行5个抗病基因的分子检测，结果见表3。
三、分子标记检测1、利用分子标记Pm4-STS检测抗白粉病基因Pm4aPm4-STS的PCR扩增参照Ma等(Ma Z.Q，Wei J.B，Cheng S.H.2004，PCR-basedmarkers for the powdery mildew resistance gene Pm4a in wheat.Theoretical andApplied Genetics，109140-145)方法和发表的Pm4F、Pm4R序列合成引物Pm4F、Pm4R进行PCR扩增。
(1)Pm4a-STS特异引物序列Pm4F5‘-TCCAGTGACCCCATCTGCTCATAC-3’(序列1)Pm4R5‘-GTGGTGTATCAAA TGTCATCAGTACTAC-3’(序列2)(2)反应体系10×PCR缓冲液 2.5μl25mM MgCl22.0μl10mM dNTPs 0.5μlTaqE(5u/ul)0.2μlPm4F(60ng/L) 1.0μlPm4R(60ng/L) 1.0μl基因组DNA(50ng/ul) 2.0μlddH2O 15.8μl总计 25μl(3)反应条件先96℃预变性1min；然后94℃ 1min，60℃ 1.5min，72℃ 1.5min共35个循环；再72℃延伸10min。
将得到的PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶进行电泳分析，如得到与具Pm4a阳性对照Khapli相同的470bp的Pm4a-STS的特异带，则待测小麦植株含有抗白粉病基因Pm4a。
2、利用分子标记Pm13-SCAR检测抗白粉病基因Pm13Pm13-SCAR的PCR扩增参照Cenci等(Ceici A，D’Ovidio R，TanzareLLa 0A，Ceoloni C，Porceddu E.Identification of molecular markers linked to Pm13，an Aegilops Longissiuma gene conferring resistance to powdery mildew in wheat，Theor.Appl.Genet.，1999，98448-454)方法以及发表的P13F和P13R序列合成引物进行PCR扩增。
(1)Pm13-SCAR特异引物序列P13F5’-CGCCAGCCAATTATCTCCATGA-3’(序列3)P13R5’-AGCCATGCGCGGTGTCATGTGAA-3’(序列4)(2)反应体系10×PCR缓冲液 2.5μl25mM MgCl21.5μl10mM dNTPs 0.5μlTaqE(5u/ul) 0.2μlP13F(50ng/L)1.0μlP13R(50ng/L)1.0μl基因组DNA(50ng/ul) 2.0μlddH2O 16.3μl总计25μl(3)反应条件先94℃预变性5min；然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，共40个循环；再72℃延伸10min。
将得到的PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶进行电泳分析，如果得到与具Pm13阳性对照PM776-1相同的564bp的Pm13-SCAR特异带，则待测小麦植株含有抗白粉病基因Pm13。
3、利用分子标记Pm21-SCAR检测抗白粉病基因PmVPMV与Pm21均位于簇毛麦染色体6V短臂上，由于6VS与小麦部分同源染色体难以重组、交换，所以Pm21的PCR标记可用于检测PmV。
Pm21-SCAR的PCR扩增利用Pm21D和Pm21C引物和Liu等方法(Liu Z Y，SunQ X，Ni Z F.Development of SCAR markers linked to the Pm21 gene conferringresistance to the powdery mildew in common wheat.Plant Breeding，1999，118215-219)进行。
(1)Pm21-SCAR特异引物序列Pm21C5’-CACTCTCCTCAAACCTTGCAAG-3’(序列5)
Pm21D5’-CACTCTCCTCCACTAACAGAGG-3’(序列6)(2)反应体系除引物外同Pm13。
(3)反应条件先94℃预变性5min；然后94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 2min，共35个循环；最后72℃ 10min。
将得到的PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶进行电泳分析，如果得到与具PmV阳性对照Pm97033相同的1400bp的Pm21(V)-SCAR特异条带，则待测小麦植株含有抗白粉病基因PmV。
4、利用分子标记Bdv2-SCAR检测抗黄矮病基因Bdv2Bdv2-SCAR的PCR扩增采用引物SC-W37U和SC-W37L和张增艳等方法(张增艳，辛志勇，陈孝，王晓萍，刘景芳，杜丽璞.源于L1的小麦抗黄矮病基因的特异PCR标记及辅助育种的研究.作物学报，2000，28(4)486-491)进行。
(1)Bdv2-SCAR特异引物序列SC-W37U5’-ACGAATTCCCAGCTAAACGCCCTC-3(序列7)SC-W37L5’-TCATTGTTGATCTTGCATGGTCGTAG-3’(序列8)(2)Bdv2反应体系10×PCR缓冲液 2.5μl25mM MgCl22.5μl2.5mM dNTPs 2.0μlTaqE(5u/ul) 0.2μlSC-W37U(5umol/L) 1.0μlSC-W37U(5umol/L) 1.0μl基因组DNA(25ng/ul)2.0μlddH2O13.8μl总计 25μl(3)扩增条件先96℃预变性1min；然后94℃ 1min，64℃ 1min，72℃ 2min，共35个循环；最后72℃ 10min。
将得到的PCR产物在1.2％琼脂糖凝胶进行电泳分析，如果得到与具Bdv2阳性对照HW642相同的450bp的Bdv2-SCAR特异带，则待测小麦植株含有抗黄矮病基因Bdv2。
5、利用分子标记YrX-SSR检测抗条锈病基因YrXYrX-SSR的PCR扩增利用SSR引物gwm501和刘朝辉等方法(刘朝辉，林志珊，陈孝，马有志，徐世昌，张增艳，辛志勇，王辉.小麦新种质YW243抗条锈病的染色体定位.麦类作物学报，2005，25(1)13-16)进行。
(1)YrX-SSR引物gwm501序列gwm501-F 5’-GGCTATCTCTGGCGCTAAAA-3’(序列9)gwm501-R 5’-TCCACAAACAAGTAGCGCC-3’(序列10)(2)YrX反应体系10×PCR缓冲液2.5μl25mM MgCl20.8μl2.5mM dNTPs 1.6μlTaqE(5u/ul) 0.2μlgwm501-F(4umol/L)1.5μlgwm501-R(4umol/L)1.5μl基因组DNA(40ng/ul) 2.0μlddH2O 14.9μl总计 25μl(3)扩增条件先94℃预变性5min；然后94℃ 1min，60℃ 1min，72℃ 2min，共45个循环；最后72℃延伸7min。
PCR扩增产物在6％聚丙烯酰胺凝胶进行电泳、硝酸银银染分析，如果得到与具YrX阳性对照YW243相同的160-180bp的YrX-SSR特异带，则待测小麦植株含有抗条锈病基因YrX。
对经步骤二的田间抗病性鉴定的春性04P161～04P170(BC2F2)与冬性04S003-1～04S003-10各10个单株按照上述方法利用分子标记进行抗白粉病基因、抗黄矮病基因和抗条锈病基因检测。
春性材料检测结果如表1所示，从田间抗白粉病、条锈病、黄矮病的春性材料04P161～04P170(BC2F2)10个单株，均检测到抗条锈病基因YrX(图1)，至少一个抗白粉病基因Pm4a，Pm13，PmV，除04P164中未检测到抗黄矮病基因Bdv2外，其它9个单株均检测到抗黄矮病基因Bdv2，分子标记结果与田间抗性结果基本一致。
表1春性材料BC2F2单株的分子标记检测
注“+”表示检测到该基因，“-”表示未检测到该基因。
其中，利用SSR引物Xgwm501PCR扩增春性04P161-170(BC2F2)10个单株的YrX-SSR结果如图1所示，10个单株均可扩增出160-180bp的YrX-SSR特异带(箭头示目的条带)；MpBR322 DNA/Msp I marker；1.YW243；2.中国春(CS)；3.04P161；4.04P162；5.04P163；6.04P164；7.04P165；8.04P166；9.04P167；10.04P168；11.04P169；12.04P170。
对兼抗白粉病、条锈病、黄矮病的冬性材料04S003-1～04S003-10的抗白粉病、抗条锈病、抗黄矮病基因进行分子检测，结果如表2。表2表明，所检测的10个冬性单株，均是2～5个抗病基因聚合体，其中一个单株04S003-4聚合了Pm4a+Pm+PmV+YrX+Bdv2五个抗病基因，04S003-1～04S003-2、04S003-7～04S003-10六个单株聚合了Pm4a+PmV+YrX+Bdv2四个抗病基因，04S003-3、04S003-6两个单株聚合了Pm4a+Pm13+YrX+Bdv2四个抗病基因，分子标记结果与田间抗性结果基本一致。
表2冬性小麦种质BC3F1单株分子标记
从表1得知，10个春性小麦BC2F2单株大部分具有3-4个抗病基因。若想在后代中保持多个抗性基因，就要求对每代材料中每个基因都进行跟踪检测，选择稳定的抗性基因聚合体作为多抗亲本。
对春性小麦BC2F2材料的自交株系(BC2F3)95个单株进行了Pm4a、Pm13、PmV、Bdv2、YrX五个抗性基因的分子标记跟踪检测，04P161的自交单株记为04P161-1～04P161-10，依此类推，结果如表3和图2～6所示。
表3春性BC2F3代自交株系分子标记检测结果(成株期)
注R示抗白粉病；S示感白粉病；+示检测到该基因；-示未检测到该基因)
由表3得知，在95个自交株系BC2F3单株中，选择到聚合Pm4a+PmV+YrX+Bdv2、Pm4a+Pm13+YrX+Bdv2四个基因兼抗白粉病、条锈病和黄矮病3种病害的单株分别有18个和3个，聚合PmV+Bdv2+YrX、Pm13+Bdv2+YrX三个抗性基因兼抗白粉病、条锈病和黄矮病3种病害的的分别有46个和7个单株。上述结果证实，通过分子标记选择抗性基因聚合体自交后代，获得3-4个抗病基因聚合体的数目增加。从BC2F2单株及其自交株系BC2F3单株的抗病基因分子检测结果得知，抗病基因特别是杂合基因型和外源抗病基因在回交、自交过程中会发生分离，所以利用分子标记对每代材料进行选择非常必要。
图2中，箭头示470bp的Pm4a-STS特异带；M.PCR markers(购自华美生物工程公司)；1.Khapli；2CS；3.04P169-7；4.0469-8；5.4P169-9；6.04P169-10；7.04P170-1；8.04P170-2；9.04P170-3；10.04P170-4；11.04P 170-5；12.04P170-6；13.04P 170-7；14.04P170-8；15.04P170-9；16.04P170-10。图3中，箭头示564bp的Pm13-SCAR特异带；M.100bp ladders；1.Pm776-1；2.CS；3.04P168-3；4.04P168-4；5.04P168-5；6.04P168-6；7.04P168-7；8.04P168-8；9.04P168-9；10.04P168-10；11.04P165-1；12.04P165-2；13.04P165-3；14.04P165-4；15.04P165-5；16.04P165-6。图4中，箭头示1400bp的PmV-SCAR特异带；M.100bpladders；1.CS；2.Pm97033；3.04P166-1；4.04P166-2；5.04P166-3；6.04P166-4；7.04P 166-5；8.04P 166-6；9.04P 166-7；10.04P 166-8；11.04P 166-9；12.04P166-10；13.04P167-2；14.04P167-3；15.04P167-4；16.04P167-5。图5中，箭头示450bp的Bdv2-SCAR特异带；M.100bp ladders；1.HW642；2.CS；3.04P166-1；4.04P166-2；5.04P166-3；6.04P166-4；7.04P166-5；8.04P166-6；9.04P166-7；10.04P166-8；11.04P166-9；12.04P166-10；13.04P167-2；14.04P167-3；15.04P167-4；16.04P167-5。图6中，箭头示160-180bp的YrX特异带，MpBR322DNA/Msp I markers；1.YW243；2.中国春；3.04P165-1；4.04P166-2；5.04P161-1；6.04P161-2；7.04P161-3；8.04P161-4；9.04P161-5；10.04P161-6；11.04P161-7；12.04P161-8；13.04P161-9；14.04P161-10；15.04P162-1；16.04P162-2。
序列表<160>10<210>1<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>1tccagtgacc ccatctgctc atac 24<210>2<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>2gtggtgtatc aaatgtcatc agtactac 28<210>3<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>3cgccagccaa ttatctccat ga 22<210>4
<211>23<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>4agccatgcgc ggtgtcatgt gaa 23<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>5cactctcctc aaaccttgca ag 22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>6cactctcctc cactaacaga gg 22<210>7<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>7acgaattccc agctaaacgc cctc 24<210>8<211>26<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>8tcattgttga tcttgcatgg tcgtag 26<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>9ggctatctct ggcgctaaaa 20<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>
<400>10tccacaaaca agtagcgcc 19
权利要求
1.一种辅助选育兼抗白粉病，条锈病和黄矮病小麦种质的方法，是利用Pm4a的STS标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因Pm4a，利用Pm13的SCAR标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因Pm13，利用Pm21的SCAR标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因PmV，利用Bdv2的SCAR标记检测待测小麦中有无抗黄矮病基因Bdv2，利用YrX的SSR标记检测待测小麦中有无抗条锈病基因YrX。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述利用Pm4a的STS标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因Pm4a的方法如下以待测小麦的基因组DNA为模板，用由序列表中序列1的核苷酸序列和序列2的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测小麦得到470bp的DNA片段，则该待测小麦中含有抗白粉病基因pm4a。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述利用Pm13的SCAR标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因Pm13的方法如下以待测小麦的基因组DNA为模板，用由序列表中序列3的核苷酸序列和序列4的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测小麦得到564bp的DNA片段，则该待测小麦中含有抗白粉病基因Pm13。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述利用Pm21的SCAR标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因PmV的方法如下以待测小麦的基因组DNA为模板，用由序列表中序列5的核苷酸序列和序列6的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测小麦得到1400bp的DNA片段，则该待测小麦中含有抗白粉病基因PmV。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述利用Bdv2的SCAR检测待测小麦中有无抗黄矮病基因Bdv2的方法如下以待测小麦的基因组DNA为模板，用由序列表中序列7的核苷酸序列和序列8的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测小麦得到450bp的DNA片段，则该待测小麦中含有抗黄矮病基因Bdv2。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述利用YrX-SSR检测待测小麦中有无抗条锈病基因YrX的方法如下以待测小麦的基因组DNA为模板，用由序列表中序列9的核苷酸序列和序列10的核苷酸序列组成的一对引物进行PCR扩增，如待测小麦扩增到160-180bp的DNA片段，则该待测小麦中含有抗条锈病基因YrX。
全文摘要
本发明公开了一种选育多基因聚合的兼抗白粉病，条锈病和黄矮病小麦种质的方法。该方法利用Pm4的STS标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因Pm4a，利用Pm13的SCAR标记待测小麦中有无抗白粉病基因Pm13，利用Pm21的SCAR标记检测待测小麦中有无抗白粉病基因PmV，利用Bdv2的SCAR标记检测待测小麦中有无抗黄矮病基因Bdv2，利用YrX的SSR标记检测待测小麦中有无抗条锈病基因YrX。本发明的方法，可准确地检测出目的基因的存在、测试材料中抗性基因的个数和具体归属，克服了常规表型鉴定的局限性，特别是在多个抗病基因聚合体检测，缩短育种周期，加快育种速度上，为选育抗白粉病，条锈病和黄矮病的小麦新品系(种)提供了一种快捷的选择方法和基因型明确、丰富的新种质。
文档编号C12Q1/68GK1904063SQ20051008714
公开日2007年1月31日 申请日期2005年7月27日 优先权日2005年7月27日
发明者张增艳, 辛志勇, 陈孝, 林志珊, 曾祥艳, 徐惠君, 杜丽璞 申请人:中国农业科学院作物科学研究所