一种微生物细胞转化法生产2-酮基-d-葡萄糖酸的方法
【专利摘要】本发明提供一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，包括：A：以氧化葡萄糖酸杆菌DSM?2003的基因工程菌株为菌种制备静息细胞，其中，所述基因工程菌株是指过表达葡萄糖酸脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌，葡萄糖酸脱氢酶的基因来源于所述氧化葡萄糖酸杆菌，具有如SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；B：制备含有葡萄糖或葡萄糖酸的转化液，葡萄糖的浓度为200～250g/L，葡萄糖酸的浓度为200～300g/L；C：向所述转化液中加入30～60g/L静息细胞进行转化，即得所述2-酮基-D-葡萄糖酸。本发明提供的方法具有转化率高、产物单一、分离纯化简单、节约生产成本、细胞易回收、可重复利用等优点。
【专利说明】一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及微生物细胞转化领域，更具体地涉及一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法。
【背景技术】
[0002]2_酮基-D-葡萄糖酸(2-keto-D-gluconic acid, 2-KGA)是目前国际上大规模生产的有机酸之一，主要用作D-异抗坏血酸(EA)及其盐类(如D-异抗坏血酸钠，EN)的合成前体，而EA和EN作为维生素C的同分异构体，具有很强的抗氧化性，作为一种可代谢抗氧化剂，其防腐效果大大超过维生素C，而价格不到维生素C的二分之一，应用前景十分广泛。目前，EN已作为一种新型的食品抗氧、防腐和保鲜剂广泛应用于肉类、水果、饮料等食品中。2-KGA还具有多种工业用途，如饲料添加剂，洗涤剂的促进剂，水泥增塑剂和摄影显影剂等。
[0003]目前，2-KGA的生产方法主要有化学合成法、酶法和发酵法(如US3255093)三种。
[0004]美国专利US2153311报道了一种利用铬酸和硫酸铁为催化剂的2-KGA的化学合成方法，但此过程反应时间长(12h~3d)、产量低(40%)。美国专利US4620034和US6018034还报道了一种化学合成方法，即利用金属Pt/Pb作为催化剂，在通入O2的条件下将葡萄糖氧化形成2-KGA。此方法虽然大大缩短了反应的时间，但是底物投料量很低(只有5%左右)，而且反应条件控制严苛，生成的产物易降解。
[0005]美国专利US4351902公开了一种以葡萄糖为原料，使用吡喃糖_2_氧化酶、葡萄糖-2-氧化酶和葡萄糖-1-氧化酶催化的两步氧化反应生产2-KGA的方法。酶法合成中，虽然在较低的底物浓度(50g/ L)下即可得到90%以上的转化率，但此方法因为酶的制作成本高，限制了实现规模化生产，而且反应过程中会生成过氧化氢，这对酶活产生不利影响，底物浓度无法提高。
[0006]发酵法是指利用微生物发酵过程直接将底物(如葡萄糖)转化成2-KGA。目前2-KGA的工业生产中最广泛采用的方法是发酵法。发酵法生产中，一般通过流加底物，最高的2-KGA生产水平达到7.66g/L/h，底物浓度达到300_400g/L。发酵法具有生产条件温和、易放大、生产成本相对较低等优点。但是，发酵法生产过程仍然存在以下几个方面的问题:(I)发酵周期长，一般需要几十到上百小时；(2)发酵过程放热量大，冷却循环水用量大，能耗高；(3)发酵液组成比较复杂，提取成本较高；(4)废渣产量相对较大，菌丝体过滤困难，活性炭、珍珠岩等物质用量大，副产物给企业带来处理压力。
[0007]因此，有必要提供一种更环保、经济、高效的2-酮基-D-葡萄糖酸的生产方法。
【发明内容】
[0008]本发明的目的是提供一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，从而解决现有技术中2-酮基-D-葡萄糖酸的化学合成法反应时间长、产量低、反应条件严苛，酶法生产成本高、生成过氧化氢影响酶活，以及发酵法发酵周期长，放热量大，提取成本较高，废渣处理量大的缺陷。[0009]为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:
[0010]提供一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，包括以下步骤:A:以氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株为菌种制备静息细胞，其中，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株是指过表达葡萄糖酸脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌，所述葡萄糖酸脱氢酶的基因来源于所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003，具有如SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列:制备含有葡萄糖或葡萄糖酸的转化液，所述转化液中葡萄糖的浓度为200~250g/L，葡萄糖酸的浓度为200~300g/L ;C:向所述含有葡萄糖或葡萄糖酸的转化液中加入步骤A中制备的所述静息细胞进行转化，所述静息细胞的加入量为30~60g/L，即得所述2-酮基-D-葡萄糖酸。 [0011]所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的构建所采用的是PBBR1MCS5质粒。
[0012]所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的构建所采用的是tufB启动子。
[0013]所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的构建包括以下步骤:以氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因组DNA为模板，PCR扩增获得葡萄糖酸脱氢酶的gadh基因片段；将质粒PBBR1MCS5以Sac1、XbaI酶切，然后与同样经过SacI，XbaI酶切的tufB启动子连接，得到重组表达质粒PBBRlMCS5-PtufB ;将所述扩增获得的gadh基因片段以Xbal、BamHI酶切，然后与同样经Xbal、BamHI酶切的PBBRlMCS5_PtufB载体连接，得到重组表达质粒pBBRlMCS5-PtufB_gadh ;将所述重组表达质粒pBBRlMCS5_PtufB-gadh电转化至氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003中，获得所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株。
[0014]步骤A中，所述静息细胞的制备是将所述菌种通过发酵培养至对数末期，冷冻离心，PBS缓冲液洗涤两次，收集菌体，从而获得去除营养成分的静息细胞。
[0015]步骤C中，所述转化的温度为28~32°C，时间为20~24h。
[0016]优选地，所述转化的温度为30°C。
[0017]步骤C还包括在反应过程中用2M NaOH溶液调节反应溶液的pH使其维持在6.0。
[0018]所述转化液中葡萄糖的浓度为200g/L，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的静息细胞的加入量为60g/L。
[0019]所述转化液中葡萄糖酸的浓度为300g/L，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的静息细胞的加入量为30g/L。
[0020]本发明中，静息细胞是指将在生长培养基上培养至一定时间后、用适当的方法收集并用缓冲液进行洗涤的微生物细胞，是去除营养成分、终止生长的微生物细胞。
[0021]本发明公开了一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，提供的氧化葡萄糖酸杆菌工程菌能快速且几乎等量地转化葡萄糖或葡萄糖酸生成2-KGA，本发明中2-KGA的最大浓度达到297.2g/L以上，时空产率达到llg/L/h，是所有专利和文献报道的最高值。相比现有技术中的发酵法生产，使用静息细胞催化法生产具有转化率高、产物单一、分离纯化简单、节约生产成本、细胞易回收、可重复利用等优点。
【具体实施方式】
[0022]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
[0023]本发明中所采用的微生物菌株为一株氧化葡萄糖酸杆菌(保藏号DSM 2003)的基因工程菌，该基因工程菌是指过表达了葡萄糖酸脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌。
[0024]本发明中所采用的过表达了葡萄糖酸脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌的具体构建方法如下:
[0025](I)引物设计:根据葡萄糖酸脱氢酶，即SEQ ID NO:1所述的基因序列，设计扩增葡萄糖酸脱氢酶基因(gadh)的PCR引物gadh_f和gadh_r。根据文献报道的氧化葡萄糖酸杆菌(G.0xydans621H)的PtufB启动子的核苷酸序列，分别设计引物PtufB_f和PtufB_r (弓丨物由上海捷瑞生物工程有限公司合成)。引物序列如下:
[0026]gadh_f:5’-CTATCTAGAGGAGAAACCTGTGCCCCCCATG-3’ ；
[0027]gadh_r: 5，-GAGGGATCCTTCAGTTCAGTGAGACCGCATCATC-3，；
[0028]PtufB_f:5，-ACTGAGCTCCGATGGTAAGAAATCCACTGC-3，；
[0029]PtufB_r: 5，-ATATCTAGACCAAAACCCCGCTCCACC-3，。
[0030]为了便于与表达载体的酶切连接，引物gadh_f上引入XbaI酶切位点，引物gadh_r上引入BamHI酶切位点，引物PtufB_f上引入SacI酶切位点，引物PtufB_r上引入XbaI酶切位点。
[0031](2)基因gadh的克隆:将氧化葡萄糖酸杆菌培养18_22h，离心收集对数中后期的菌体，使用Tiangen公司的细菌基因组提取试剂盒，按照说明书上针对革兰氏阴性菌的步骤进行操作，提取氧化葡萄糖酸杆菌基因组DNA。并以其为模板，gadh_f作为引物，PCR扩增gadh基因。并以PtufB_f^PPtufB_r作为引物，PCR扩增tufB启动子。反应体系:5XBuffer5 μ 1，PrimeSTAR HS DNA Polymerase 0.5 μ l,dNTP 2 μ 1，DNA 模板 I μ 1，引物(10 μ mol/L)各 0.75 μ 1，加 ddH20 至总体积 25 μ I。
[0032](3)表达载体的构建:将质粒PBBR1MCS5以Sac1、XbaI酶切，然后与同样经过SacI7XbaI酶切的tufB启动子连接，得到重组表达质粒，命名为PBBRlMCS5_PtufB。将回收的gadh基因片段以Xba1、BamHI酶切，然后与同样经Xba1、BamHI酶切的pBBRlMCS5_PtufB载体连接，得到重组表达质粒，命名为pBBRlMCS5-PtufB-gadh。得到的重组表达质粒PBBRlMCS5-PtufB-gadh经酶切鉴定，符合预期结果。最后对鉴定为正确的重组表达质粒PBBRlMCS5-PtufB-gadh进行测序，测序结果显示，克隆入表达载体的葡萄糖酸脱氢酶基因gadh的序列与SEQ ID NO:1所示序列一致。
[0033](4)基因工程菌的构建:将获得的重组质粒pBBRlMCS5-PtufB_gadh电转化方法转化至氧化葡萄糖酸杆菌G.0xydans DSM 2003,获得基因工程菌G.0xydan (tuf-gadh),通过测序验证该重组质粒构建正确。
[0034]在细菌中，使用质粒对膜蛋白进行表达，使其转运并具有活性，是不易实现的。在表达载体的构建过程中，我们尝试了多种质粒和启动子，如PET系列质粒，pBBR系列质粒；如tufB启动子，ndh2启动子，gadh基因自身启动子等等。将使用如上所述的质粒与启动子构建的质粒进行比较，最后发现使用PBBR1MCS5质粒和tufB启动子构建的基因工程菌株能够过量表达有活性的膜蛋白且催化活性最好，故本专利使用PBBR1MCS5质粒和tufB启动子。
[0035]基因工程菌G.0xydan (tuf-gadh)的发酵培养和静息细胞制备，具体方法如下:[0036]培养基配方(g/L):山梨醇80，酵母粉 20，(NH4) 2S045，KH2PO4L 5，MgSO4.7Η200.5，蒸馏水1000mL。培养基于121°C灭菌20min后备用。
[0037](I)从固体培养基平板上挑取氧化葡萄糖酸杆菌基因工程菌的单菌落接种于含有25μ g/mL的硫酸庆大霉素的液体培养基试管中，在30°C，250rpm的摇床上培养至对数生长期(20-24h)作为种子液，然后按10%的比例转接于含有同样培养基的发酵罐中培养，pH5.0-6.0，30°C，400 ~600rpm，培养至对数末期。
[0038](2)将发酵罐培养的氧化葡萄糖酸杆菌，通过冷冻离心机，4°C，7000rpm离心20min收集起来。用20mM的pH5.8的PBS缓冲液洗涤两次，再次收集菌体，获得后续催化反应用的静息细胞。 [0039]使用基因工程菌G.0xydan (tuf-gadh)的微生物细胞转化法生产2-KGA的方法，具体如下:
[0040]实施例1:
[0041]7L发酵罐中转入含有200g/L葡萄糖的水溶液，加入60g/L的静息细胞，在30°C、空气通气量8L/min、搅拌转速600rpm的条件下反应，反应过程中用2M NaOH溶液调节pH维持在6.0，21h左右上清液中葡萄糖转化完全，2-KGA (钠盐)产率97.75%，浓度可达234.6g/L，时空产率为11.17g/L/h。
[0042]实施例2:
[0043]7L发酵罐中转入含有250g/L葡萄糖的水溶液，加入60g/L的静息细胞，在30°C、空气通气量8L/min、搅拌转速600rpm的条件下反应，反应过程中用2M NaOH溶液调节pH维持在6.0，34h左右上清液中葡萄糖转化完全，2-KGA(钠盐)产率94.74%，浓度可达284.22g/L，时空产率为8.36g/L/h。
[0044]实施例3:
[0045]7L发酵罐中转入含有200g/L葡萄糖酸钠的水溶液，加入30g/L的静息细胞，在30°C、空气通气量8L/min、搅拌转速600rpm的条件下反应，15h左右上清液中葡萄糖酸转化完全，2-KGA (钠盐)浓度可达198.2g/L，时空产率为13.2g/L/h。
[0046]实施例4:
[0047]7L发酵罐中转入含有300g/L葡萄糖酸钠的水溶液，加入30g/L的静息细胞，在30°C、空气通气量8L/min、搅拌转速600rpm的条件下反应，27h左右上清液中葡萄糖酸转化完全，2-KGA (钠盐)浓度可达297.2g/L，时空产率为llg/L/h。
[0048]以上实施例中，葡萄糖的测定在葡萄糖测定仪(S⑶-1V，山东省科学院生物中心制造)上完成。葡萄糖酸和2-酮基-D-葡萄糖酸的测定采用高效液相色谱(HPLC)分析方法，HPLC的操作条件如下:
[0049]色谱工作站:安捷伦1100
[0050]色谱柱:有机酸色谱柱87H3
[0051]流动相:0.008%硫酸
[0052]流速:0.4ml/min
[0053]检测温度:35°C
[0054]检测波长:2IOnm
[0055]以上所述的，仅为本发明的较佳实施例，并非用以限定本发明的范围，本发明的上述实施例还可以做出各种变化。即凡是依据本发明申请的权利要求书及说明书内容所作的简单、 等效变化与修饰，皆落入本发明专利的权利要求保护范围。本发明未详尽描述的均为常规技术内容。
【权利要求】
1.一种微生物细胞转化法生产2-酮基-D-葡萄糖酸的方法，其特征在于，包括以下步骤: A:以氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株为菌种制备静息细胞，其中，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株是指过表达葡萄糖酸脱氢酶的氧化葡萄糖酸杆菌，所述葡萄糖酸脱氢酶的基因来源于所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003，具有如SEQ IDNO:1所示的核苷酸序列； B:制备含有葡萄糖或葡萄糖酸的转化液，所述转化液中葡萄糖的浓度为200~250g/L，葡萄糖酸的浓度为200~300g/L ； C:向所述含有葡萄糖或葡萄糖酸的转化液中加入步骤A中制备的所述静息细胞进行转化，所述静息细胞的加入量为30~60g/L，即得所述2-酮基-D-葡萄糖酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM2003的基因工程菌株的构建所采用的是PBBR1MCS5质粒。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM2003的基因工程菌株的构建所采用的是tufB启动子。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM2003的基因工程菌株的构建包括以下步骤: 以氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因组DNA为模板，PCR扩增获得葡萄糖酸脱氢酶的gadh基因片段；` 将质粒PBBR1MCS5以Sac1、XbaI酶切，然后与同样经过SacI，XbaI酶切的tufB启动子连接，得到重组表达质粒pBBRlMCS5-PtufB ； 将所述扩增获得的gadh基因片段以Xba1、BamHI酶切，然后与同样经Xba1、BamHI酶切的pBBRlMCS5-PtufB载体连接，得到重组表达质粒pBBRlMCS5_PtufB-gadh ； 将所述重组表达质粒pBBRlMCS5-PtufB-gadh电转化至氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003中，获得所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤A中，所述静息细胞的制备是将所述菌种通过发酵培养至对数末期，冷冻离心，PBS缓冲液洗涤两次，收集菌体，从而获得去除营养成分的静息细胞。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C中，所述转化的温度为28~32°C，时间为20~24h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述转化的温度为30°C。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤C还包括在反应过程中用2MNaOH溶液调节反应溶液的PH使其维持在6.0。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化液中葡萄糖的浓度为200g/L，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的静息细胞的加入量为60g/L。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转化液中葡萄糖酸的浓度为300g/L，所述氧化葡萄糖酸杆菌DSM 2003的基因工程菌株的静息细胞的加入量为30g/L。
【文档编号】C12P7/58GK103627740SQ201310598049
【公开日】2014年3月12日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】林金萍, 魏东芝, 李克非 申请人:华东理工大学