专利名称：游离细胞或固定化细胞微生物转化生产l-鸟氨酸的方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) CGMCC No.3212游离细胞或固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的制备方法。
背景技术：
目前，国内外L-鸟氨酸的制备方法主要有水解法和发酵法，水解法是以精氨酸 为原料，经碱法水解或利用精氨酸酶水解得到L-鸟氨酸。而发酵法是利用精氨酸或者瓜 氨酸缺陷型的微生物来发酵生产L-鸟氨酸，常用的微生物有谷氨酸棒杆菌、乳酸发酵 短杆菌、解烃棒杆菌和大肠杆菌等。由于化学水解法生产L-鸟氨酸条件苛刻，产物多为 DL型外消旋体，分离困难，且大量使用有机溶剂，给环境带来严重污染；而发酵法生产 L-鸟氨酸产量相对较低(国外最高仅有50g/L左右)，并且发酵液中的杂质多，后续分离 困难；采用上述方法生产L-鸟氨酸成本较高，同时L-鸟氨酸产率不高，给实际推广应用 带来了很大困难。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212游离细胞或固定化细胞多次重复使用，縮短了生产周期、 提高了L-鸟氨酸的产率，降低了L-鸟氨酸的生产成本，使大规模生产L-鸟氨酸成为 可能。其中固定化细胞即采用海藻酸钠包埋法对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis) CGMCC No.3212进行固定化，把固定化好的细胞填充到填充柱中，然后让含有L-精氨酸 的碳酸缓冲溶液以一定的流速流经填充柱。该制备方法通过选用合适的固定化条件对苏 云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212进行固定化，把固定化细胞填充到 一定高径比的填充柱中，再以此填充柱作为催化剂，让含有L-精氨酸的碳酸缓冲液以一 定的流速流经此填充柱，在最佳反应条件下催化合成L-鸟氨酸。该方法具有固定化细胞 活性高、稳定性好、寿命长，产物杂质少，生产周期短、可连续化，工艺操作简单、生 产成本低、操作安全等优点。本发明分离筛选到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212菌
体在转化生产L-鸟氨酸后可作为Bt生物农药，对鳞翅目昆虫具有高毒力，而对人畜没有 任何的危害。本发明的整体技术构思是 游离细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸，该方法由下列工艺步骤组成a.将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212菌种接种到试管中的
斜面培养基制成斜面菌种；b.将斜面菌株扩大培养作为种子液； C.将种子液接入发酵罐中进行发酵； d.将发酵完的游离菌体离心后移入L-精氨酸溶液，以L-精氨酸作为底物进行转
4化；e.游离细胞微生物转化法生产的L-鸟氨酸的分离纯化。 固定化细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸，该方法由下列工艺步骤组成A.将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212菌种接种到试管中
的斜面培养基制成斜面菌种；B.将斜面菌株扩大培养作为种子液； C.将种子液接入发酵罐中进行发酵；D.固定化苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212细胞的制备；
E.把固定化细胞填充到填充柱中； R把含有L-精氨酸的碳酸缓冲溶液流经填充柱，催化合成L-鸟氨酸；
G.固定化细胞微生物转化法生产的L-鸟氨酸的分离纯化。
Bt生物农药的制备 将游离细胞或固定化细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸后的苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212湿菌体细胞以一定的质量比与水配成溶液，喷洒到 被保护植被表面，以完全湿润为量。
本发明的具体工艺步骤及工艺条件是 步骤a和步骤A中斜面培养基由下列重量份组分组成 葡萄糖5-10份、玉米浆5-10份、尿素2.0-3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0 份、磷酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，琼脂15-20份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为6.0-7.0、温度25-35"、培养时间为12-24 小时。 步骤b和步骤B中种子液与步骤c和步骤C中发酵液由下列重量份组分组成
葡萄糖10-50份、玉米浆5-10份、尿素2.0-3.5份、硫酸镁0.5-1.0份、磷酸氢二 钾1.0份、磷酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份和水1000份；
发酵的工艺条件为发酵液接种量为5-10%， pH值为6.0-7.0，培养温度为 25-35°C，通风量为0.5-1.0vvm，搅拌转速为120-180转/分钟，发酵时间为24-36小时。
步骤d中转化条件为转化液中底物L-精氨酸的质量浓度为20-120g/L，硫酸 锰的质量浓度为0.05-0.1% ;转化温度为25-40°C，转化时间为24-48小时，搅拌转速为 80-120转/分钟。在此转化条件下，L-精氨酸转化为L-鸟氨酸的转化率达95-99.5%， 每升转化液中含L-鸟氨酸29-142g。 步骤e中游离细胞微生物转化法生产的L-鸟氨酸的分离纯化包括以下四个步 骤a、转化液在4000转/分钟条件下离心除去菌体，离心时间为20分钟； b、把经过a步骤后的转化液清液通过磺酸型阳离子交换树脂柱进行分离纯化，
磺酸型阳离子交换树脂为732型强酸性阳离子交换树脂； c、把经过b步骤的转化液真空减压浓縮、结晶，即可得到纯度达到97%以上的
L-鸟氨酸纯品，真空浓縮真空度为O.lMPa，温度为6(TC，结晶温度为4°C ;d、把经过c步骤的晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为6(TC，干燥后
的成品为白色粉末状。
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步骤D中苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212细胞固定化
将质量百分比浓度为3-9%的海藻酸钠加蒸馏水煮沸溶解，冷却后与等体积细胞 浓度为50-100g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mmX6mm的乳胶管，在一端采用内径 约1.0mm-4.0mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至50-100drop/min，在 搅拌条件下，将混合液逐滴滴入0.1-1.0mol/L硼酸和0.5-2.0mol/L CaCV混合液中，形成大 小均匀的固定化凝胶珠，直径最大差值幼.5mm，固定5-15h后取出，制得直径为2-5mm 的凝胶珠，固定化后的细胞酶活为未固定化菌体的99%。
步骤E中把固定化细胞填充到填充柱中 填充柱为高径比为15-35的有机玻璃柱，以固定化细胞填充填充柱。步骤F把 含有L-精氨酸的碳酸缓冲溶液流经填充柱，催化合成L-鸟氨酸 L-精氨酸的浓度为30-150g/L，碳酸缓冲液(pH10.0)的物质的量浓度为
0.2-0.4mol/L，催化反应温度为25-40°C，缓冲溶液流速为0.3-0.5BV/h。 在此反应条件
下，L-精氨酸的转化率为95-99%，每升发酵液中含L-鸟氨酸29-142g，固定化细胞转化
480-960h后，细胞催化活力仍是稳定的，即固定化细胞的使用寿命为480-960h。 步骤G中固定化细胞微生物转化法生产的L-鸟氨酸的分离纯化包括以下三个步
骤a、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为6(TC;b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓縮、结晶，即可得到纯度达到99%以上
的L-鸟氨酸纯品，真空浓縮真空度为0.1MPa，温度为6(TC，结晶温度为4°C ;c、把经过b步骤的晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为6(TC，干燥后
的成品为白色粉末状。 本发明所用的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212已经在中 国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212，保藏时间为2009年07月25日。苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212的筛选，由下列工艺步
骤组成 (l)广泛采集土样，用无菌水制成悬液，涂布于选择性培养基平板上培养； (2)长出的单菌落接种到发酵培养基中培养，离心后置于L-精氨酸溶液中转化，
进行初筛，选择L-精氨酸转化率高的菌株保藏在斜面培养基上； (3)将初筛后的菌株进行物理、化学诱变。
步骤(1)中选择性培养基由下列重量份组分组成 葡萄糖5-10份、玉米浆5-10份、尿素2.0-3.5份、硫酸镁0.5-1.0份、磷酸氢二 钾1.0份、磷酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，L-精氨酸5-15份、琼脂 15-20份和水1000份； 选择性培养基培养条件为pH值为6.0-7.0、温度25-35t:、培养时间为12-36小 时。 步骤(2)中发酵培养基由下列重量份组分组成 葡萄糖10-50份、玉米浆5-10份、尿素2.0-3.5份、硫酸镁0.5-1.0份、磷酸氢二 钾1.0份、磷酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份和水1000份；
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发酵的工艺条件为发酵液接种量为5-10%， pH值为6.0-7.0，培养温度为 25-35°C，通风量为0.5-1.0vvm，搅拌转速为120-180转/分钟，发酵时间为24-36小时。
步骤(2)中转化条件为将发酵完的菌体离心后移入底物L-精氨酸的质量浓度 为20-120g/1，硫酸锰的质量浓度为0.05-0.1 %的转化液中；转化温度为25-40°C，转化时 间为24-48小时，搅拌转速为80-120转/分钟。
步骤(2)中斜面培养基由下列重量份组分组成 葡萄糖5-10份、玉米浆5-10份、尿素2.0-3.5份、硫酸镁0.5-1.0份、磷酸氢二钾 1.0份、磷酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，琼脂15-20份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为6.0-7.0、温度25-35"、培养时间为12-24 小时。 步骤(3)中诱变依次包括种子菌悬液的制备，诱变剂的加入量和紫外照射时间
将斜面菌种接种到含5ml生理盐水的试管中，往试管中加入体积百分比为 0.5% -2.0%的硫酸二乙酯诱变剂，在漩涡振荡器上振荡1-2分钟，取0.5ml该菌悬液涂布 平板，把平板放在紫外灯下照射20-60秒，然后把平板在黑暗中培养。培养条件为培 养温度25-35。C、培养时间为48-72小时。最后，得到苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCCNo.3212。本发明提供的利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212固定
化细胞连续生产L-鸟氨酸的方法，适用于以海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇(PVA)凝胶、琼 脂、聚氨酯、光硬化树脂或聚丙烯酸凝胶等为固定化介质固定化苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212细胞催化合成L-鸟氨酸。本发明提供的利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212固定
化细胞连续生产L-鸟氨酸的方法，适用于以有机玻璃柱、塑料柱、不锈钢柱或玻璃柱等
作为固定化细胞的填充柱。 本发明所取得的技术进步在于第一，本发明利用苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212游离
细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸，具有生产成本低，生产条件温和，转化体系中杂质较 少，工艺步骤简单，生产操作安全等优点。采用本发明生产L-鸟氨酸产量较高，每升转 化液中含有29-142gL-鸟氨酸，L-精氨酸转化率可达99.5X。通过离子交换树脂分离纯 化，纯度可达到97%以上，具有重大工业化意义。第二，本发明是通过对苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212
细胞进行固定化，以固定化细胞填充柱作为反应器，催化合成L-鸟氨酸。本发明所取 得的进步主要体现为固定化细胞使用寿命长，菌体对环境耐受度强，产物纯度高，周期 短，生产可连续化等优点。采用本发明生产L-鸟氨酸，每升发酵液中最高含142g L-鸟 氨酸，固定化细胞使用寿命为960小时，具有重大的工业化意义。第三，本发明分离筛选到的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC
No.3212在转化生产L-鸟氨酸后，还可用作生物杀虫剂，对鳞翅目昆虫具有高毒力。 实施例以下结合实施例对本发明做进一步描述。 实施例1 (1)菌种斜面培养
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将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212接种到试管中的斜面 培养基制成斜面菌种；其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成 葡萄糖5份、玉米浆5份、尿素2.5份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾1.0份、磷酸 二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，琼脂15份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为6.5、温度25°C、培养时间为24小时。
(2)接种发酵 将斜面菌株扩大培养作为种子液； 将种子液按5%的接种量接入发酵罐中进行发酵； 其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成 葡萄糖10份、玉米浆5份、尿素2.5份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾1.0份、磷 酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份和水1000份； 发酵的工艺条件为发酵液接种量为5%， pH值为6.5，培养温度为25t:，通风 量为0.5vvm，搅拌转速为120转/分钟，发酵时间为24小时。
(3)生产L-鸟氨酸 将发酵完的菌体离心后移入底物L-精氨酸的质量浓度为30g/L，硫酸锰的质量浓 度为0.05%的转化液中； 其中转化条件为转化温度为35t:，转化时间为24小时，搅拌转速为80转/分 钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L-鸟氨酸的转化率达99.5X，每升转化液中含L-鸟 氨酸29.85g。 (4)L-鸟氨酸的分离纯化，包括以下四个步骤a、转化液在4000转/分钟条件下离心除去菌体，离心时间为20分钟； b、把经过a步骤后的转化液清液通过磺酸型阳离子交换树脂柱进行分离纯化，
磺酸型阳离子交换树脂为732型强酸性阳离子交换树脂； C、把经过b步骤的转化液真空减压浓縮、结晶，即可得到L-鸟氨酸纯品，真空 浓縮真空度为0.1MPa，温度为6(TC，结晶温度为4t:;d、把经过c步骤的晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为6(TC，干燥后
的成品为白色粉末状，纯度达到97%以上。 实施例2 (1)菌种斜面培养 将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212接种到试管中的斜面 培养基制成斜面菌种； 其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成 葡萄糖8份、玉米浆8份、尿素3.0份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、磷酸 二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，琼脂20份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为6.0、温度30°C、培养时间为12小时。
(2)接种发酵 将斜面菌株扩大培养作为种子液； 将种子液按10%的接种量接入发酵罐中进行发酵；
其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成 葡萄糖25份、玉米浆10份、尿素3.0份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、磷 酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份和水1000份； 发酵的工艺条件为发酵液接种量为10%， pH值为6.0，培养温度为35t:，通 风量为l.Ovvm，搅拌转速为180转/分钟，发酵时间为24小时。
(3)生产L-鸟氨酸 将发酵完的菌体离心后移入底物L-精氨酸的质量浓度为120g/L，硫酸锰的质量 浓度为0.1%的转化液中； 其中转化条件为转化温度为25°C，转化时间为36小时，搅拌转速为100转/ 分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L-鸟氨酸的转化率达97.4X，每升转化液中含 L-鸟氨酸116.88g。 (4)L-鸟氨酸的分离纯化，包括以下四个步骤a、转化液在4000转/分钟条件下离心除去菌体，离心时间为20分钟；b、把经过a步骤后的转化液清液通过磺酸型阳离子交换树脂柱进行分离纯化，
磺酸型阳离子交换树脂为732型强酸性阳离子交换树脂； c、把经过b步骤的转化液真空减压浓縮、结晶，即可得到L-鸟氨酸纯品，真空 浓縮真空度为0.1MPa，温度为6(TC，结晶温度为4t:;d、把经过c步骤的晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为6(TC，干燥后
的成品为白色粉末状，纯度达到97%以上。 实施例3 (l)菌种斜面培养 将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212接种到试管中的斜面 培养基制成斜面菌种；其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成 葡萄糖10份、玉米浆10份、尿素3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、磷
酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，琼脂20份和水1000份； 制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.0、温度35t:、培养时间为12小时。 (2)接种发酵 将斜面菌株扩大培养作为种子液； 将种子液按10%的接种量接入发酵罐中进行发酵； 其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成 葡萄糖50份、玉米浆10份、尿素3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、磷 酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份和水1000份； 发酵的工艺条件为发酵液接种量为10%， pH值为7.0，培养温度为3(TC，通 风量为l.Ovvm，搅拌转速为180转/分钟，发酵时间为36小时。
(3)生产L-鸟氨酸 将发酵完的菌体离心后移入底物L-精氨酸的质量浓度为150g/L，硫酸锰的质量 浓度为0.1%的转化液中； 其中转化条件为转化温度为30°C，转化时间为48小时，搅拌转速为120转/分钟。在此转化条件下，精氨酸转化为L-鸟氨酸的转化率达95.0X，每升转化液中含 L-鸟氨酸142.5g。 (4)L-鸟氨酸的分离纯化，包括以下四个步骤a、转化液在4000转/分钟条件下离心除去菌体，离心时间为20分钟； b、把经过a步骤后的转化液清液通过磺酸型阳离子交换树脂柱进行分离纯化，
磺酸型阳离子交换树脂为732型强酸性阳离子交换树脂； c、把经过b步骤的转化液真空减压浓縮、结晶，即可得到L-鸟氨酸纯品，真空 浓縮真空度为0.1MPa，温度为6(TC，结晶温度为4t:;d、把经过c步骤的晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为6(TC，干燥后
的成品为白色粉末状，纯度达到97%以上。 实施例4 (l)菌种斜面培养 将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212接种到试管中的斜面 培养基制成斜面菌种； 其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成 葡萄糖5份、玉米浆5份、尿素2.5份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾1.0份、磷酸 二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，琼脂15份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为6.5、温度25t:、培养时间为24小时。
(2)接种发酵 将斜面菌株扩大培养作为种子液； 将种子液按5%的接种量接入发酵罐中进行发酵； 其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成 葡萄糖10份、玉米浆5份、尿素2.5份、硫酸镁0.5份、磷酸氢二钾1.0份、磷 酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份和水1000份； 发酵的工艺条件为发酵液接种量为5%， pH值为6.5，培养温度为25t:，通风 量为0.5vvm，搅拌转速为120转/分钟，发酵时间为24小时。
(3)菌体细胞的固定化 将质量百分比浓度为9%的海藻酸钠加蒸馏水煮沸溶解，冷却后与等体积细胞
浓度为100g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mmX6mm的乳胶管，在一端采用内径约
4.0mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至100drop/min，在搅拌条件下，
将混合液逐滴滴入0.1mol/L硼酸和l.Omol/L CaCl2混合液中，形成大小均匀的固定化凝胶
珠，直径最大差值《0.5mm，固定15h后取出，制得直径为5mm的凝胶珠，固定化后的细
胞酶活为未固定化菌体的99%。(4)固定化细胞填充到填充柱中 取一根高径比为15的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化细胞填充入填充柱内。 [OH5] (5)固定化细胞填充柱催化合成L-鸟氨酸 将精氨酸的浓度为120g/L的碳酸缓冲液(0.2mol/L， pH10.0)，在温度为3(TC条 件下，以流速为0.3BV/h流经填充柱。在此反应条件下，L-鸟氨酸的转化率为97.5X， 每升发酵液中含L-鸟氨酸117g，固定化细胞转化800h后，细胞活力仍是稳定的，即固定
10化细胞的使用寿命为800h。 (6)L-鸟氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤 a、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为6(TC; b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓縮、结晶，即可得到纯度达到99%以上
的L-鸟氨酸纯品，真空浓縮真空度为0.1MPa，温度为6(TC，结晶温度为4°C ;c、把经过b步骤的晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为60。C，干燥后
的成品为白色粉末状。 实施例5 (l)菌种斜面培养 将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212接种到试管中的斜面 培养基制成斜面菌种；其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成 葡萄糖8份、玉米浆8份、尿素3.0份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、磷酸
二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，琼脂20份和水1000份； 制备斜面菌种的工艺条件为pH值为6.0、温度3(TC、培养时间为12小时。 (2)接种发酵 将斜面菌株扩大培养作为种子液； 将种子液按10%的接种量接入发酵罐中进行发酵； 其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成 葡萄糖25份、玉米浆10份、尿素3.0份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、磷 酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份和水1000份； 发酵的工艺条件为发酵液接种量为10%， pH值为6.0，培养温度为35t:，通 风量为l.Ovvm，搅拌转速为180转/分钟，发酵时间为24小时。
(3)菌体细胞的固定化 将质量百分比浓度为5%的海藻酸钠加蒸馏水煮沸溶解，冷却后与等体积细胞
浓度为90g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mmX6mm的乳胶管，在一端采用内径约
4.0mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至80drop/min，在搅拌条件下，将
混合液逐滴滴入0.3mol/L硼酸和l.Omol/L CaCl2混合液中，形成大小均匀的固定化凝胶
珠，直径最大差值《0.5mm，固定10h后取出，制得直径为3mm的凝胶珠，固定化后的细
胞酶活为未固定化菌体的99%。(4)固定化细胞填充到填充柱中 取一根高径比为25的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化细胞填充入填充柱内。
(5)固定化细胞填充柱催化合成L-鸟氨酸 将精氨酸的浓度为150g/L的碳酸缓冲液(0.2mol/L， pH10.0)，在温度为35。C条 件下，以流速为0.4BV/h流经填充柱。在此反应条件下，L-鸟氨酸的转化率为95X，每 升发酵液中含L-鸟氨酸142.5g，固定化细胞转化720h后，细胞活力仍是稳定的，即固定 化细胞的使用寿命为720h。 (6)L-鸟氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤a、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为6(TC;
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b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓縮、结晶，即可得到纯度达到99%以上
的L-鸟氨酸纯品，真空浓縮真空度为0.1MPa，温度为6(TC，结晶温度为4°C ;c、把经过b步骤的晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为6(TC，干燥后
的成品为白色粉末状。 实施例6 (l)菌种斜面培养 将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212接种到试管中的斜面 培养基制成斜面菌种； 其中菌种斜面培养基由下列重量份组分组成 葡萄糖10份、玉米浆10份、尿素3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、磷 酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，琼脂20份和水1000份；
制备斜面菌种的工艺条件为pH值为7.0、温度35t:、培养时间为12小时。
(2)接种发酵 将斜面菌株扩大培养作为种子液； 将种子液按10%的接种量接入发酵罐中进行发酵； 其中种子液和发酵液由下列重量份组分组成 葡萄糖50份、玉米浆10份、尿素3.5份、硫酸镁1.0份、磷酸氢二钾1.0份、磷 酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份和水1000份； 发酵的工艺条件为发酵液接种量为10%， pH值为7.0，培养温度为3(TC，通 风量为l.Ovvm，搅拌转速为180转/分钟，发酵时间为36小时。
(3)菌体细胞的固定化 将质量百分比浓度为6%的海藻酸钠加蒸馏水煮沸溶解，冷却后与等体积细胞
浓度为80g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mmX6mm的乳胶管，在一端采用内径约
2.0mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至100drop/min，在搅拌条件下，
将混合液逐滴滴入0.lmol/L硼酸和2.0mol/L CaCl2混合液中，形成大小均匀的固定化凝胶
珠，直径最大差值《0.5mm，固定15h后取出，制得直径为2mm的凝胶珠，固定化后的细
胞酶活为未固定化菌体的99%。(4)固定化细胞填充到填充柱中 取一根高径比为30的有机玻璃柱作为填充柱，把固定化细胞填充入填充柱内。
(5)固定化细胞填充柱催化合成L-鸟氨酸 将精氨酸的浓度为30/L的碳酸缓冲液(0.2mol/L， pH10.0)，在温度为3(TC条件 下，以流速为0.3BV/h流经填充柱。在此反应条件下，L-鸟氨酸的转化率为99.5X，每 升发酵液中含L-鸟氨酸29.85g，固定化细胞转化960h后，细胞活力仍是稳定的，即固定 化细胞的使用寿命为960h。(6)L-鸟氨酸的分离纯化，包括以下三个步骤a、收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为6(TC;b、把经过a步骤后的反应液真空减压浓縮、结晶，即可得到纯度达到99%以上
的L-鸟氨酸纯品，真空浓縮真空度为0.1MPa，温度为6(TC，结晶温度为4°C ;c、把经过b步骤的晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为6(TC，干燥后的成品为白色粉末状。
实施例7 将游离细胞或固定化细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸后的苏云金芽孢杆菌
(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212湿菌体细胞以质量比1 : 10、 1 : 100配成溶液，
喷洒到被保护植被表面，以完全湿润为量，观察该菌体毒杀柏毛虫、赤松毛虫、玉米螟
和小菜蛾的使用效果，观察使用48小时后的害虫死亡率，对照标准苏云金芽孢杆菌标准
菌株杀虫剂，结果见表一 表一(48小时，死亡率％)
苏云金芽孢杆菌CGMCC No,3212■■■■ ' i 苏云金芽fis杆菌标准菌株 1质量比1: 101: 1001: 101: 100CK
桕毛虫64.25116248.52 ;
赤松毛虫27.513.722461 1
，35.610118,542 1 ——」
小菜蛾28.97131.5101 1 实施例8 将游离细胞或固定化细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸后的苏云金芽孢杆菌 (Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212湿菌体细胞以质量比1 : 100、 1 : 200配成溶液， 喷洒到被保护植被表面，以完全湿润为量，观察该菌体毒杀小菜蛾的使用效果，观察使 用2天、4天、6天后的害虫死亡率，对照5%氯氰菊酯杀虫剂，结果见表二
表二 苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212菌体细胞防治小
菜蛾的药效试验结果
药劍质量比平均防治效果(死1!:率％) 1
2天4 :r:6天 1
苏云金芽泡杆菌CGMCC No.3212菌体细胞濯35.664()，42.1。
苏云金芽孢杆辨CGMCC No.3212茵体细胞20032.5637.25 1
5%氯氰菊酯10004^3,359,9363.68 J
1权利要求
苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212
2. 游离细胞或固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于用权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌转化生产L-鸟氨酸，其中游离细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的方法，该方法由下列工艺步骤组成a. 将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；b. 将斜面菌种扩大培养作为种子液；c. 将种子液接入发酵罐中进行发酵，其发酵条件为发酵液接种量为5-10%， pH值为6.0-7.0，培养温度为25-35"，通风量为0.5-1.0VVm，搅拌转速为120-180转/分钟，发酵时间为24-36小时；d. 将发酵完的游离菌体离心后移入L-精氨酸溶液，以L-精氨酸作为底物进行转化，其转化条件为转化液中底物L-精氨酸质量浓度为30-150g/L，硫酸锰的质量浓度为0.05-0.1 %;转化温度为25-40°C ，转化时间为24-48小时，搅拌转速为80-120转/分钟，在此转化条件下，L-精氨酸转化为L-鸟氨酸的转化率达95-99.5%，每升转化液中含L-鸟氨酸29-142g;e. 游离细胞微生物转化法生产的L-鸟氨酸的分离纯化。固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的方法，该方法由下列工艺步骤组成A. 将苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212菌种接种到试管中的斜面培养基制成斜面菌种；B. 将斜面菌种扩大培养作为种子液；C. 将种子液接入发酵罐中进行发酵，其发酵条件为发酵液接种量为5-10%， pH值为6.0-7.0，培养温度为25-35"，通风量为0.5-1.0VVm，搅拌转速为120-180转/分钟，发酵时间为24-36小时；D. 固定化苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212细胞的制备；E. 将固定化细胞填充到填充柱中；F. 将含有L-精氨酸的碳酸缓冲液流经填充柱，催化合成L-鸟氨酸；G. 固定化细胞微生物转化法生产的L-鸟氨酸的分离纯化。
3. 根据权利要求2所述的游离细胞或固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的a和A步骤中的斜面培养基由下列重量份组分组成葡萄糖5-10份、玉米浆5-10份、尿素2.0-3.5份、硫酸镁0.5-1.0份、磷酸氢二钾1.0份、磷酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份，琼脂15-20份和水1000份。制备斜面菌种的工艺条件为pH值为6.0-7.0、温度为25-35t:、培养时间为12-24小时。
4. 根据权利要求2所述的游离细胞或固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的b和B步骤中的种子培养基与c和C步骤中发酵液由下列重量份组分组成葡萄糖10-50份、玉米浆5-10份、尿素2.0-3.5份、硫酸镁0.5-1.0份、磷酸氢二钾1.0份、磷酸二氢钾1.0份、碳酸钙2.0份、硫酸锰0.05份和水1000份。
5. 根据权利要求2所述的游离细胞或固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的e步骤中的L-鸟氨酸的分离纯化包括以下四个步骤(1) 转化液在4000转/分钟条件下离心除去菌体，离心时间为20分钟；(2) 把经过(1)步骤后的转化液清液通过磺酸型阳离子交换树脂柱进行分离纯化，磺酸型阳离子交换树脂为732型强酸性阳离子交换树脂；(3) 把经过(2)步骤的转化液真空减压浓縮、结晶，即可得到纯度达到97%以上的L-鸟氨酸纯品，真空浓縮真空度为0.1MPa，温度为6(TC，结晶温度为4°C ;(4) 把经过(3)步骤的晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为6(TC，干燥后的成品为白色粉末状。
6. 根据权利要求2所述的游离细胞或固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的D步骤中固定化苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCCNo.3212细胞的制备是利用海藻酸钠包埋法制备，其步骤是先制得质量百分比浓度为3-9%的海藻酸钠水溶液，冷却后与等体积的细胞浓度为50-100g/L的菌悬液混匀，取长度适当的4mmX6mm的乳胶管，在一端采用内径约1.0mm-4.0mm的滴头，将乳胶管装入蠕动泵，调节蠕动泵速度至50-100drop/min，在搅拌条件下，将混合液逐滴滴入0.1-1.0mol/L硼酸和0.5-2.0mol/L CaCl2混合液中，形成大小均匀的固定化凝胶珠，直径最大差值《0.5mm，固定5-15h后取出，制得直径为2-5mm的凝胶珠，固定化后的细胞酶活为未固定化菌体的99% ;细胞的固定化介质选自海藻酸钠、明胶、聚乙烯醇(PVA)凝胶、琼脂、聚氨酯、光硬化树脂或聚丙烯酸凝胶；苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212细胞的填充柱选自有机玻璃柱、塑料柱、不锈钢柱或玻璃柱，填充柱的高径比为15-35。
7. 根据权利要求2所述的游离细胞或固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的F步骤中的催化反应条件为L-精氨酸的物质的量浓度为0.65-1.0mol/L，碳酸缓冲液(pH10.0)的物质的量浓度为0.2-0.4mol/L，催化反应温度为25-40°C，缓冲溶液流速为0.3-0.5BV/h ;固定化细胞的使用寿命为480-960h。
8. 根据权利要求2所述的游离细胞或固定化细胞微生物转化生产L-鸟氨酸的方法，其特征在于所述的G步骤中的L-鸟氨酸的分离纯化包括以下三个步骤a、 收集填充柱流出的反应液，加入活性炭进行脱色，脱色温度为6(TC;b、 把经过a步骤后的反应液真空减压浓縮、结晶，即可得到纯度达到99%以上的L-鸟氨酸纯品，真空浓縮真空度为0.1MPa，温度为6(TC，结晶温度为4°C ;c、 把经过b步骤的晶体真空干燥，干燥真空度为0.1Mpa，温度为6(TC，干燥后的成品为白色粉末状。
9. 权利要求1所述的苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)CGMCC No.3212菌体细胞在游离细胞或固定化细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸后可作为Bt生物农药，其主要杀菌成分在毒杀鳞翅目昆虫上的应用。
全文摘要
本发明涉及L-鸟氨酸的制备方法，它包括斜面种子的制备，培养基的选择，游离细胞和固定化细胞转化条件的优化以及产物的提取等工艺步骤。本发明通过苏云金芽孢杆菌转化生产L-鸟氨酸，游离细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸，具有生产成本低，生产条件温和，转化体系中杂质较少，工艺步骤简单，生产操作安全等优点；固定化细胞微生物转化法生产L-鸟氨酸，具有固定化细胞使用寿命长，菌体对环境耐受度强，产物纯度高，周期短，生产可连续化等优点。采用本发明生产L-鸟氨酸产量高，每升转化液中含有29-142g L-鸟氨酸，L-精氨酸转化率可达99.5％。
文档编号A01P7/04GK101691555SQ20091017649
公开日2010年4月7日 申请日期2009年9月17日 优先权日2009年9月17日
发明者陈畅 申请人:陈畅;张骁;丁伟