一株利用甲醇制备高赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母菌及其应用

一株利用甲醇制备高赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母菌及其应用
【专利摘要】本发明涉及一株利用甲醇制备高赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母菌及其应用，所述菌株分类命名为多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）AP23，已于2016年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO:M 2016173。本发明利用等离子体诱变技术，以甲醇作为唯一碳源筛选出能生产富含赖氨酸的单细胞蛋白的菌株，在此基础上进一步结合甲醇梯度筛选获得高效利用甲醇的多形汉逊酵母菌。利用本发明的菌株能够实现高密度发酵，利用5 L发酵罐进行甲醇蛋白生产，最终菌体湿重达到350?400 g/L，甲醇蛋白干重达到115?130 g/L，蛋白质含量达到68%，其中赖氨酸含量高达60 mg/g。本发明对动物饲料蛋白添加剂的发展具有重大的社会意义和经济价值。CCTCC NO：M 201617320160405
【专利说明】
一株利用甲醇制备高赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母菌及 其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及生物工程领域，特别是一株利用甲醇生产富含赖氨酸单细胞蛋白的多 形汉逊酵母菌及其应用。
【背景技术】
[0002] 蛋白质资源短缺是全世界面临的重大课题，各国都在重视加强开发新型蛋白资源 的研究。其中，工业化最快的是单细胞蛋白生产，并被认为是解决人类蛋白质资源匮乏最有 效的途径之一。
[0003] 单细胞蛋白（single cell protein, SCP)，是指酵母菌、霉菌、真菌、非致病性细 菌等单细胞微生物体内所产生的菌体蛋白质，其蛋白质含量一般占菌体干物质的40%~60%。 以工业甲醇为原料生产出来的甲醇蛋白被称之为第二代单细胞蛋白，与天然蛋白相比，其 粗蛋白含量在70%以上，比鱼粉和大豆都要高，且含有丰富的必需氨基酸、矿物质和维生素， 可以部分替代鱼粉、大豆、骨粉、肉类以及脱脂奶粉，且具有不依靠耕地、不受气候影响、蛋 白质质量稳定等优点。
[0004] 从20世纪60年代开始，就有不少国家开展了甲醇蛋白的研究，并发展成为世界性 的热门研究课题。其中占领先地位的要属英国ICI公司，1980年便有规模为10万t/a的装置 建成投产。ICI公司生产的甲醇蛋白商品名为"Pruteen"。"Pruteen"产品中含有72%的粗蛋 白，蛋氨酸和赖氨酸含量与鱼粉非常相近，作为富含热量、维生素、矿物质及高蛋白的饲料 在市场上销售。1983年美国Phillips石油公司又开发出甲醇蛋白生产新工艺，改进发酵罐 热交换和氧传递条件，可生产高密度甲醇蛋白。随后，德国Hoechst-Uhde、日本三菱瓦斯化 学、瑞典Norprotein和法国IFP等公司也建立了中试装置。20世纪70年代以来，我国也开始 甲醇蛋白的研究。但到目前为止，甲醇蛋白的产业化在我国仍处于起步阶段，国内还没有工 业化的甲醇蛋白生产装置，一些单位也停止了对甲醇蛋白的研究开发。
[0005] 甲醇是一种平台化工品，其来源广泛，我国的甲醇产能已经超过4500万t/a，并 呈继续增加趋势，而国内的甲醇需求量仅为1000万t/a，多数甲醇企业生存难以为继，急需 开发甲醇下游产品，而以甲醇为原料生产蛋白资源，可以缓解甲醇的供需矛盾。目前，甲醇 价格低廉，甲醇蛋白生产成本低，以甲醇蛋白代替传统的鱼粉和豆类等蛋白，将会降低饲料 成本，提高饲养效率，加速我国饲料工业的发展，同时也是解决目前蛋白饲料短缺，依赖进 口这一矛盾的有效途径。
[0006] 甲醇蛋白生产菌株有细菌和酵母等，酵母菌的耐酸性能非常好，可以减少大规模 培养时污染的风险，在廉价的合成或半合成培养基上能高密度生长，此外多形汉逊酵母又 具有相对较高的最优生长温度，可以提高生长速度，缩短发酵时间，同时降低对发酵设备的 制冷要求，从而有利于大规模发酵生产。但是如何能够利用酵母菌实现高效利用甲醇生产 富含某种氨基酸的单细胞蛋白还未有报道。

【发明内容】

[0007] 本发明的第一目的在于提供一株利用甲醇制备高赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊 酵母菌。
[0008] 为实现本发明的第一目的，本发明采用的技术方案如下： 一株高效利用甲醇生产富含赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母，其分类命名为多形汉 逊酵母Hansenula polymorphaAP23,其保藏编号为：CCTCC NO: M 2016173。保藏日是2016 年4月5日。
[0009] 本发明所述的多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23的筛选方法为，将多形汉 逊酵母出发菌株(ATCC34438)经等离子体诱变后，以甲醇作为唯一碳源，利用高浓度甲醇平 板筛选得到甲醇耐受能力较强的菌株，再经摇瓶发酵筛选获得高含量蛋白和高含量赖氨酸 的菌株，最后经高浓度甲醇驯化，获得能高效利用甲醇生产富含赖氨酸单细胞蛋白的多形 汉逊酵母。
[0010] 多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23的筛选具体步骤如下： (1)等离子体诱变:将多形汉逊酵母原始菌株活化培养，100 ml三角瓶装液量为20 ml，37°C摇床中200 rpm振荡培养24 h，得到处于对数生长期的菌液，将培养的细胞稀释至 0D6q()=3-4,滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以80-120W作 为射频功率，以10-30SLM作为气体流量，以10-1800S作为辐照时间对菌株进行等离子体诱 变。
[0011] (2)高浓度甲醇平板初筛:将诱变后的载片置于装有1-2 mL生理盐水的具塞试管 中，剧烈震荡，将载片上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于含500 mM甲醇的培养基平板 上，37 °C培养2-3天，挑选出生长旺盛的菌落。
[0012] (3)富含赖氨酸单细胞蛋白菌株的筛选:选取生长旺盛的单菌落分别接种于包含 500 mM甲醇的200 ml发酵培养基中，37°C，200 rpm培养48h，离心收集菌体蛋白，检测菌体 中蛋白的含量以及赖氨酸的含量，选择蛋白含量和赖氨酸含量均较高的菌株。
[0013] (4)高浓度甲醇驯化:选取步骤(3)中的蛋白含量和赖氨酸含量均较高的菌株继续 接种至含500 mM甲醇的选择培养基上，待其生长至对数期后，转接至含IM甲醇的选择培养 基上;之后按同样方法转接至含1.5 M的选择培养基上，最后再将菌液转移到含2 M甲醇的 选择培养基中，重复驯化2次后，取0.2 ml菌液涂布在包含2 M甲醇的选择培养基平板上，37 °〇恒温培养，获取多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23。
[0014] 本发明的第二目的在于多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23在制备高赖氨 酸单细胞蛋白中的应用。本发明提供了一种利用多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23 在制备高赖氨酸单细胞蛋白中应用的方法，具体步骤如下： (1)多形汉逊酵母菌AP23在5 L发酵罐中高密度发酵:多形汉逊酵母菌AP23在5 L发酵 罐中采用发酵培养基进行菌体蛋白生产，其中，发酵培养基装液量为2L，121°C灭菌15 min， 同时对接种管道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，待发酵培养基 降至37°C左右时，用氨水调节pH至5.0,加入种子液进行发酵，发酵温度为37°C，控制溶氧 20%-60%，搅拌转速250-500 rpm;24小时后，培养基中甘油耗尽，开始流加甲醇，用气相监测 甲醇浓度，使其控制在〇. 5%-2%之间，每8个小时取样测定菌体OD6qq和湿重，96-100小时后， 发酵结束，收集发酵液。
[0015] (2)富含赖氨酸甲醇蛋白的提取:将上述步骤（1)在5 L发酵罐中收集的发酵液经 离心机5000r/min连续离心浓缩获得菌体，用清水洗涤菌体后称量其湿重;将收集的菌体于 55 °C烘干至质量恒定，收集干粉即为单细胞甲醇蛋白。
[0016] 本发明的有益效果在于： 本发明采用等离子体诱变多形汉逊酵母，利用甲醇平板筛选出蛋白含量和赖氨酸含量 较高的菌株，在此基础上利用高浓度甲醇驯化，使得该菌株能高效地利用甲醇生产单细胞 蛋白。在5L发酵罐中，利用甘油30 g/L，甲醇500 ml/L可生产115-130g/L菌体蛋白，其中赖 氨酸含量可达60mg/g，并且获得的甲醇蛋白干粉中不含甲醇，是替代饲料蛋白的理想原料， 具有重大的社会意义和经济价值。
[0017] 生物材料说明 本发明所述的生物材料，其分类命名为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)AP23， 已保藏于中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC)，保藏编号为CCTCC Ν0:Μ 2016173,保藏日 期为:2016年4月5日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学。
【具体实施方式】
[0018] 下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0019] 实施例1 本实施例说明将多形汉逊酵母原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法。
[0020] 多形汉逊酵母原始菌株进行第一步等离子体诱变的方法如下： 将多形汉逊酵母原始菌株活化培养，100 ml三角瓶装液量为20 ml，37°C摇床中200 rpm振荡培养24 h，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；取新鲜培养的细胞稀释至细胞浓度 0D6q()=3-4，滴加在灭菌冷却后的载片上，用无菌空气吹干；以氦气为放电气体，以100W作为 射频功率，以10SLM作为气体流量，以10-1800S作为辐照时间对菌株进行等离子体诱变，诱 变后，将载体上的菌膜洗脱下来，计算存活率。实验结果表明450 s是最佳的诱变辐照时间。
[0021] 实施例2 本实例说明筛选高效利用甲醇生产富含赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母的方法。 [0022]其中，所使用的培养基配方： (1)种子培养基:酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，其余为水。
[0023] (2)选择培养基：甲醇500禮，硫酸铵I g/L，磷酸二氢钾I g/L，硫酸镁0.7 g/L，氯 化钙0.4 g/L，酵母膏I g/L，琼脂粉1.5 g/L，其余为水，pH自然。
[0024] (3)发酵培养基:85%磷酸26.7 ml/L，二水硫酸钙0.93 g/L，硫酸钾18.2 g/L，二 水硫酸镁14.9 g/L，氢氧化钾4.13 g/L，甘油30 g/L，微量元素溶液4 ml/L，水I L; (4)发酵培养基2:85%磷酸26.7 ml/L，二水硫酸钙0.93 g/L，硫酸钾18.2 g/L，二水硫 酸镁14.9 g/L，氢氧化钾4.13 g/L，甲醇20ml/L，微量元素溶液4 ml/L，水I L，培养时每24h 添加20ml/L甲醇。
[0025] 所述的微量元素溶液为:五水硫酸铜6 g/L，碘化钾0.088 g/L，一水硫酸锰3 g/L， 二水钼酸钠0.2 g/L，硼酸0.02 g/L，六水氯化钴0.5 g/L，氯化锌20 g/L，七水硫酸亚铁65 g/L，生物素0.2 g/L，质量浓度为98 %的浓硫酸5 ml/L，其余为水。
[0026] 筛选步骤具体如下： (1)高浓度甲醇平板初筛： 将实施例1中诱变后的载片置于装有l-2ml生理盐水的具塞试管中，剧烈震荡，将载片 上的菌株洗脱，稀释成不同浓度涂布于含500mM甲醇的选择培养基平板上，37 °C培养3-4天， 挑选出生长旺盛的菌落。
[0027] (2)富含赖氨酸单细胞蛋白菌株的筛选:选取生长旺盛的单菌落分别接种于包含 500 mM甲醇的200 ml发酵培养基中，37°C，200 rpm培养48h，离心收集菌体蛋白，检测菌体 中蛋白的含量以及赖氨酸的含量，选择蛋白含量和赖氨酸含量均较高的菌株。
[0028] (3 )耐高浓度甲醇的驯化:选取步骤2中的蛋白含量和赖氨酸含量均较高的菌株继 续接种至含500 mM甲醇的选择培养基上，待其生长至对数期后，转接至含IM甲醇的选择培 养基上;之后按同样方法转接至含1.5 M的选择培养基上，最后再将菌液转移到含2 M甲醇 的选择培养基中，重复驯化2次后，取0.2 ml菌液涂布在包含2 M甲醇的选择培养基平板上， 37°C恒温培养，获取多形汉逊酵母Hansenula polymorphaAP23。
[0029] (4)摇瓶发酵筛选： 将步骤(3)获取的菌株AP23和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度37°C，100 mL三角瓶装液量20 mL，培养时间24 h。然后在发酵培养基中发酵，接种量10%(v/v)，发酵 温度37°C，IL三角瓶装液量200 mL，培养24h后，静置过夜，更换发酵培养基2,发酵时间72 h 后检测各菌株的蛋白含量和赖氨酸含量如表1所不： 表1
实施例3 本实施例说明实施例2的多形汉逊酵母AP23的遗传稳定性测试，菌株传代发酵实验如 下所示。
[0030] 利用摇瓶发酵，检测突变株AP23的传代稳定性。菌株AP23传代发酵试验结果如表2 所示： 表2菌株AP23传代发酵试验结果
从表中可以看出，经过7次传代，菌株AP23蛋白和赖氨酸含量稳定，传代稳定性良好。 [0031] 实施例4 本实施例说明多形汉逊酵母AP23高效利用甲醇生产富含赖氨酸单细胞蛋白的应用。 [0032]其中，所使用的培养基配方： (1)种子斜面培养基:酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，其 余为水。
[0033] (2)选择培养基：甲醇500禮，硫酸铵I g/L，磷酸二氢钾I g/L，硫酸镁0.7 g/L，氯 化钙0.4 g/L，酵母膏I g/L，其余为水，pH自然。
[0034] (3)发酵培养基:85%磷酸26.7 ml/L，二水硫酸钙0.93 g/L，硫酸钾18.2 g/L，二 水硫酸镁14.9 g/L，氢氧化钾4.13 g/L，甘油30 g/L，微量元素溶液4 ml/L，水I L; 所述的微量元素溶液为:五水硫酸铜6 g/L，碘化钾0.088 g/L，一水硫酸锰3 g/L，二水 钼酸钠0.2 g/L，硼酸0.02 g/L，六水氯化钴0.5 g/L，氯化锌20 g/L，七水硫酸亚铁65 g/L， 生物素0.2 g/L，质量浓度为98 %的浓硫酸5 ml/L，其余为水。
[0035] 多形汉逊酵母AP23菌株在5 L发酵罐中高密度发酵生产甲醇蛋白的方法，步骤如 下： (1)种子的培养:将多形汉逊酵母AP23菌株用划线法接种至种子斜面培养基上，37 °C培 养48小时，取1支培养好的斜面种子，用3 mL无菌水将种子冲洗下来，接种至包含200 mL选 择培养基的I L三角瓶中，37°C，220 rpm振荡培养约24小时至0D=9-10。
[0036] (2)5 L发酵罐中高密度发酵：多形汉逊酵母AP23菌株在5 L发酵罐中采用发酵培 养基进行菌体蛋白生产，其中，发酵培养基装液量为2L，12TC灭菌15 min，同时对接种管 道、氨水及甲醇流加管道、取样口管道、空气过滤器进行灭菌，待发酵培养基降至37°C左右 时，用氨水调节PH至5.0,加入种子液进行发酵，发酵温度为37°C，控制溶氧20%-60%，搅拌转 速250-500 rpm; 24小时后，培养基中甘油耗尽，开始流加甲醇，用气相监测甲醇浓度，使其 控制在0.5%-2%之间，每8个小时取样测定菌体OD 6qq和湿重，96-100小时后，发酵结束，收集 发酵液。随后将发酵液经离心机5000 r/min连续离心浓缩获得菌体，用清水洗涤菌体后称 量其湿重;将收集的菌体于55°C烘干至质量恒定，收集干粉即为单细胞甲醇蛋白。
[0037] 最终菌体湿重达到350-400 g/L，甲醇蛋白干重达到115-130 g/L，蛋白质含量达 到68%，其中赖氨酸含量高达60 mg/g。
【主权项】
1. 一株利用甲醇制备高赖氨酸单细胞蛋白的多形汉逊酵母菌，其特征在于，分类命名 为多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)AP23,已于2016年4月5日保藏于中国典型培养物 保藏中心CCTCC，保藏编号:CCTCC NO:M 2016173。2. 权利要求1所述多形汉逊酵母菌的制备方法，其特征在于，制备步骤包括采用高浓度 甲醇平板初筛，再经摇瓶发酵，最后经高浓度甲醇驯化。3. 根据权利要求2所述多形汉逊酵母菌的制备方法，其特征在于，所述初筛和发酵步骤 中甲醇浓度为500mM。4. 根据权利要求2所述多形汉逊酵母菌的制备方法，其特征在于，所述驯化步骤甲醇浓 度梯度变化，最终为2 M。5. 权利要求1所述多形汉逊酵母菌在高赖氨酸单细胞蛋白制备中的应用。6. 根据权利要求5所述多形汉逊酵母菌在高赖氨酸单细胞蛋白制备中的应用，其特征 在于，包括如下步骤： (1) 种子培养：将多形汉逊酵母AP23菌株接种至种子斜面培养基上，37°C培养48小时 后，取培养好的斜面种子接种至包含选择培养基的三角瓶中，37°C，220 rpm振荡培养约24 小时至0D=9-10; (2) 发酵培养:多形汉逊酵母AP23菌株在发酵罐中采用发酵培养基进行菌体蛋白生产， 121°C灭菌15 min，待发酵培养基降至37°C时，调节pH至5.0,加入种子液进行发酵，发酵温 度为37°C，控制溶氧20%-60%，搅拌转速250-500 rpm; 24小时后，培养基中甘油耗尽，开始流 加甲醇，用气相监测甲醇浓度，使其控制在〇. 5%-2%之间，每8个小时取样测定菌体OD6qq和湿 重，96-100小时后，发酵结束，收集发酵液； (3) 提取蛋白：将发酵液经离心机5000 r/min连续离心浓缩获得菌体，用清水洗涤菌体 后称量其湿重;将收集的菌体于55°C烘干至质量恒定，收集干粉。7. 根据权利要求6所述多形汉逊酵母菌在高赖氨酸单细胞蛋白制备中的应用，其特征 在于，采用培养基成分如下： 种子斜面培养基:酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，其余 为水； 选择培养基：甲醇500 mM，硫酸铵1 g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.7 g/L，氯化钙0.4 g/L，酵母膏1 g/L，其余为水，pH自然； 发酵培养基:85%磷酸26.7 ml/L，二水硫酸钙0.93 g/L，硫酸钾18.2 g/L，二水硫酸镁 14.9 g/L，氢氧化钾4.13 g/L，甘油30 g/L，微量元素溶液4 ml/L，水1 L; 所述的微量元素溶液为:五水硫酸铜6 g/L，碘化钾0.088 g/L，一水硫酸锰3 g/L，二水 钼酸钠0.2 g/L，硼酸0.02 g/L，六水氯化钴0.5 g/L，氯化锌20 g/L，七水硫酸亚铁65 g/L， 生物素0.2 g/L，质量浓度为98 %的浓硫酸5 ml/L，其余为水。
【文档编号】C12N13/00GK105861343SQ201610343015
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月23日
【发明人】姜岷, 章文明, 马江锋, 董维亮, 戴仲雪, 吴若凡
【申请人】南京工业大学