一种自然发酵豆酱中微生物胞外宏蛋白质组的提取方法与流程

本发明属于微生物领域，特别地涉及一种自然发酵豆酱中微生物胞外宏蛋白质组的提取方法。

背景技术：

豆酱作为营养丰富、香气馥郁的传统发酵食品，是很多家庭的必备之选。农家酱采用自然接种微生物进行发酵，手工式的生产无法保证酱的均一稳定，易被有害杂菌污染，而工业化的生产，由于发酵菌种单一，周期短，盐浓度高，同样面临来自安全性、营养性、方便性以及需求多样性等方面的挑战。因此对豆酱中微生物来源及其功能进行深入研究，从而全面把握营养物质、风味物质生成机理，解决豆酱生产过程中的种种问题，保障消费者的安全食用，具有重要意义。

2004年Rodriguez-Valera首次提出宏蛋白质组的概念，是指复杂环境微生物群落中所有生物的蛋白质组总和。豆酱中微生物宏蛋白质组还鲜有报道，它是指豆酱中所有微生物产生的全部蛋白质。豆酱微生物宏蛋白质组研究，可为发现功能蛋白质标记物、种系发生以及微生物群体的功能性分析提供依据，也为进一步揭示微生物与豆酱品质形成关系奠定基础。

本专利阐述了一种自然发酵豆酱中微生物胞外宏蛋白质组的提取方法，为后续研究奠定了基础。

技术实现要素：

本发明目的在于提供一种自然发酵豆酱中微生物胞外宏蛋白质组的提取方法。

一种自然发酵豆酱中微生物胞外宏蛋白质组的提取方法，包括以下步骤：

A、取新鲜采集的豆酱放于离心桶中，加入磷酸盐缓冲液，放入直径0.2-0.8cm的玻璃珠20-50颗，人工震荡离心桶8-15min；

B、将玻璃珠取出，以5000-8000r/min的转速，离心15-30min，收集上清液；

C、上清液以10000-12500r/min离心10-25min，弃去沉淀物，收集上清。在上清中加入等量裂解液，150-180w超声10-15min，工作3s停5s；

D、在样品液中加入等体积的丙酮溶液，放入-20℃冰箱静置2h，10000-12500r/min离心10-25min，弃上清，收集沉淀物，重复两次，沉淀物冰上风干得到蛋白质粉末；

E、按照0.1g/ml的比例向蛋白质粉末中加入裂解液，20-30w超声助溶8-12min，工作2s停3s，10000-12500r/min离心50-75min，取上清液。

优选的，所述的步骤B中，磷酸盐缓冲液的配置方法为：

以0.1mol/L，pH＝7.0磷酸盐缓冲液(1000ml)为例：(1)0.1mol/L磷酸氢二钾溶液(1000ml)：称取22.8220g磷酸氢二钾于1000ml容量瓶中，加入去离子水混匀定容。(2)0.1mol/L磷酸二氢钾溶液(1000ml)：称取13.6090g磷酸二氢钾于1000ml容量瓶中，加入去离子水混匀定容。取610ml溶液(1)和390ml溶液(2)混匀，加入8g氯化钠，0.2g氯化钾混匀后，调pH至7.0，现用现配。

优选的，所述的步骤C和E中的裂解液(20ml)的配置方法为：称取尿素8.4081g，硫脲3.0448g，CHAPS(3-[3-(胆酰胺基丙基)二甲氨基]丙磺酸盐)0.8g，蛋白酶抑制剂PMSF(苯甲基黄酰氟)0.0035g，DTT(二硫苏糖醇)0.2g于20ml容量瓶中，加入去离子水混匀后定容，现用现配。

优选的，所述的步骤D中，所述的丙酮溶液为10％TCA-丙酮溶液，10％TCA-丙酮(100ml)：取10g TCA于100ml容量瓶，加入冰丙酮混匀后定容。

本发明公开了一种自然发酵豆酱中微生物胞外宏蛋白质组的提取方法，取新鲜采集的自然发酵豆酱于离心桶中，5000-8000r/min离心收集上清液，上清液10000-12500r/min离心收集上清，超声裂解，丙酮除杂，冰上风干得到胞外蛋白质，向胞外蛋白质中加入裂解液，超声助溶，离心后得到蛋白质清液。本方法可为发现功能蛋白质标记物、种系发生以及微生物群体的功能性分析提供依据，也为进一步揭示微生物与豆酱品质形成关系奠定基础。

除了上面所描述的目的、特征和优点之外，本发明还有其它的目的、特征和优点。下面将对本发明作进一步详细的说明。

附图说明

图1为豆酱中微生物胞外宏蛋白质组SDS-PAGE结果图，其中，1为实验室样品胞外宏蛋白质组的SDS-PAGE胶图，2为沈阳样品胞外宏蛋白质组的SDS-PAGE胶图，3为葫芦岛样品胞外宏蛋白质组的SDS-PAGE胶图，4为朝阳样品胞外宏蛋白质组的SDS-PAGE胶图。

具体实施方式

以下对本发明的实施例进行详细说明，但是本发明可以根据权利要求限定和覆盖的多种不同方式实施。

实施例1

以实验室自制农家酱为原材料，采用本专利请求中叙述的方法，提取豆酱中微生物胞外宏蛋白质组。具体步骤如下：

A、取新鲜采集的豆酱70g放于500ml离心桶中，加入200ml磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.0)，放入直径0.5cm的玻璃珠30颗，人工震荡离心桶10min；

B、将玻璃珠取出，6000r/min，离心20min，收集上清液；

C、上清液12000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清。在上清中加入等体积裂解液，160w超声10min，工作3s停5s；

D、样品液中加入等体积的丙酮溶液，放入-20℃冰箱静置2h，10000-12500r/min离心10-25min，弃上清，收集沉淀物，重复两次，沉淀物冰上风干得到蛋白质粉末；

E、按照0.1g/ml向胞外蛋白质中加入裂解液，26w超声助溶10min，工作2s停3s，12000r/min，离心1h，取上清液。

采用SDS-PAGE对胞外蛋白质进行检测：分离胶浓度为12％(体积∶体积)，浓缩胶浓度为5％(体积∶体积)。电泳时间设置为80v，15min；120v至跑完。利用Image Lab软件对所得的SDS-PAGE电泳胶图进行扫描。

实施例2

以沈阳农家酱为原材料，采用本专利请求中叙述的方法，提取豆酱中微生物胞外宏蛋白质组。具体步骤如下：

A、取新鲜采集的豆酱70g放于500ml离心桶中，加入200ml磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.0)，放入直径0.2cm的玻璃珠30颗，人工震荡离心桶10min；

B、将玻璃珠取出，6000r/min，离心20min，收集上清液；

C、上清液12000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清。在上清中加入等体积裂解液，160w超声10min，工作3s停5s；

D、在样品液中加入等体积的丙酮溶液，放入-20℃冰箱静置2h，10000-12500r/min离心10-25min，弃上清，收集沉淀物，重复两次，沉淀物冰上风干得到蛋白质粉末。

E、按照0.1g/ml向胞外蛋白质中加入裂解液，26w超声助溶10min，工作2s停3s，12000r/min，离心1h，取上清液。

采用SDS-PAGE对胞外蛋白质进行检测：分离胶浓度为12％(体积∶体积)，浓缩胶浓度为5％(体积∶体积)。电泳时间设置为80v，15min；120v至跑完。

实施例3

以葫芦岛农家酱为原材料，采用本专利请求中叙述的方法，提取豆酱中微生物胞外宏蛋白质组。具体步骤如下：

A、取新鲜采集的豆酱70g放于500ml离心桶中，加入200ml磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.0)，放入直径0.8cm的玻璃珠30颗，人工震荡离心桶10min；

B、将玻璃珠取出，6000r/min，离心20min，收集上清液；

C、上清液12000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清。在上清中加入等体积裂解液，160w超声10min，工作3s停5s；

D、在样品液中加入等体积的丙酮溶液，放入-20℃冰箱静置2h，10000-12500r/min离心10-25min，弃上清，收集沉淀物，重复两次，沉淀物冰上风干得到蛋白质粉末。

E、按照0.1g/ml向胞外蛋白质中加入裂解液，26w超声助溶10min，工作2s停3s，12000r/min，离心1h，取上清液。

采用SDS-PAGE对胞外蛋白质进行检测：分离胶浓度为12％(体积∶体积)，浓缩胶浓度为5％(体积∶体积)。电泳时间设置为80v，15min；120v至跑完。

实施例4

以朝阳农家酱为原材料，采用本专利请求中叙述的方法，提取豆酱中微生物胞外宏蛋白质组。具体步骤如下：

A、取新鲜采集的豆酱70g放于500ml离心桶中，加入200ml磷酸盐缓冲液(0.1mol/L，pH＝7.0)，放入直径0.5cm的玻璃珠30颗，人工震荡离心桶10min；

B、将玻璃珠取出，6000r/min，离心20min，收集上清液；

C、上清液12000r/min离心20min，弃去沉淀物，收集上清。在上清中加入等体积裂解液，160w超声10min，工作3s停5s；

D、在样品液中加入等体积的丙酮溶液，放入-20℃冰箱静置2h，10000-12500r/min离心10-25min，弃上清，收集沉淀物，重复两次，沉淀物冰上风干得到蛋白质粉末。

E、按照0.1g/ml向胞外蛋白质中加入裂解液，26w超声助溶10min，工作2s停3s，12000r/min，离心1h，取上清液。

采用SDS-PAGE对胞外蛋白质进行检测：分离胶浓度为12％(体积∶体积)，浓缩胶浓度为5％(体积∶体积)。电泳时间设置为80v，15min；120v至跑完。

图1为豆酱中微生物胞外宏蛋白质组SDS-PAGE结果图，其中，1为实验室样品胞外宏蛋白质组的SDS-PAGE胶图，2为沈阳样品胞外宏蛋白质组的SDS-PAGE胶图，3为葫芦岛样品胞外宏蛋白质组的SDS-PAGE胶图，4为朝阳样品胞外宏蛋白质组的SDS-PAGE胶图。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。