决明SoICS基因、用于克隆决明SoICS基因的引物及其克隆方法
【专利摘要】本发明涉及生物【技术领域】，尤其是决明SoICS基因、用于克隆决明SoICS基因的引物及其克隆方法；该基因核苷酸序列为SEQ?ID?NO：1；克隆步骤包括：决明总RNA提取和反转录；3′-RACE和5′-RACE扩增；决明ICS基因全长cDNA序列扩增；PCR产物的克隆纯化与筛选。本发明方法首次获得决明SoICS基因的全序列，同时通过一种克隆决明SoICS基因的引物组和克隆方法，它能快速准确地克隆决明SoICS基因的全序列，为后续决明SoICS基因分子研究提供了理论基础。
【专利说明】决明SoICS基因、用于克隆决明SoICS基因的引物及其克隆方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物【技术领域】，尤其是决明SoICS基因、用于克隆决明SoICS基因的引物及其克隆方法。
【背景技术】
[0002]决明为小品种中药材，在我国资源丰富，决明子不仅具有广泛的药用价值，而且还是很好的保健食品原料，属中华人民共和国卫生部规定的食药同源的药材之一。蒽醌类化合物是地球上最丰富的天然醌类物质，有着重要的药用价值和工业价值。它是中药决明子及许多其它中药材(如大黄、虎杖、何首乌等)的主要药用成分之一。据报道，异分支酸合酶(Isochorismate synthase, ICS)是从莽草酸途径向合成蒽醌和水杨酸两个分支途径的一个关键酶，其活性控制着分支酸向此两个分支途径的流量，ICS是水杨酸和蒽醌类化合物合成的限速酶。在枯草杆菌、绿脓杆菌和大肠细菌中有关ICS的研究较多。植物中ICS的研究相对滞后，在拟南芥中有较详细的研究，在茜草、诺丽、杨属植物、长春花等植物中也有报道。
[0003]目前还没有决明SoICS基因相关报道，克隆决明SoICS基因的全序列是相当有必要的。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种决明SoICS基因、用于克隆植物SoICS基因的引物及其克隆该方法。
[0005]为实现上述目的，本发明采用的技术方案是:一种决明SoICS基因，该基因核苷酸序列为 SEQID NO:1。
[0006]进一步:所述基因的编码区序列编码氨基酸为SEQID NO:2。
[0007]一种用于克隆决明SoICS基因的引物组，所述引物组序列如下:
[0008]ICS3-1
[0009]5' -GTTTGTGGG (T/C)TTCCA(A/G)CAGAAG-3'
[0010]GeneRacer 3' P 5' -CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3'
[0011]ICS3-25' -TATGC(T/G)GGGACAGGGATAGT-3'
[0012]GeneRacer 3' NP 5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
[0013]ICS5-1
[0014]5' -CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCA-3'
[0015]Clontech UPM5' -GAGCAACTTGGTGAACTGAG-3'
[0016]ICS5-25' -GAGTTCTAGCTCATCCCACTC-3'
[0017]Clontech NUP5' -AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3'
[0018]FsoICS3S5' -ATGGCAACCGGAGCTGCACACA-3'[0019]RsoICS3S
[0020]5' -ATTGATGGTGCTCAATGCTCATATACAGTC-3'。
[0021]一种克隆决明SoICS基因的方法，包括如下步骤
[0022]步骤一、决明总RNA提取和反转录；
[0023]步骤二、3'-RACE 和 5' -RACE 扩增；
[0024]步骤三、决明ICS基因全长cDNA序列扩增；
[0025]步骤四、PCR产物的克隆纯化与筛选。
[0026]进一步的:所述步骤二中3' -RACE和5' -RACE扩增包括如下步骤:
[0027]A、决明ICS基因cDNA的3'末端一扩反应
[0028]使用基因特异引物ICS3-1和GeneRacer Kit提供的GeneRacer3' P为引物对，用从各植物部位获得的cDNA的等量混合cDNA为模板，进行3'末端一扩反应；扩增体系为 ddH2017.25ii 1，10Xbuffer2.1，dNTP(10mmol L-1)0.5u I, MgC12 (25mmol L-1)
1.5u 1,3 ' P (10 u mo I L-1 )0.5 u I, ICS3-1 (10 u mol L_l) 0.5 ii 1，总 cDNA0.5 ii 1，Taq聚合酶(5U iil-1) 0.25 iil，总体积 25 ill ;扩增程序为:94 °C 2min，94°C lmin, 56 °C lmin,72°C lmin, 35 个循环 ，72°C延伸 IOmin ；
[0029]B、决明ICS基因cDNA的3'末端巢扩反应
[0030]使用基因特异引物ICS3-2和GeneRacer Kit提供的物GeneRacer3 ' NP为引物对，以0.5iil3' -RACE—扩产物作为模板，进行决明ICS基因的3'末端巢扩反应，反应体系和扩增程序同一扩；
[0031]C、决明ICS基因cDNA的5 ^末端一扩反应
[0032]使用5 ' RACE基因特异引物ICS5-1与SMARTTMRACE试剂盒提供的引物ClontechUPM为引物对，用总cDNA为模板，进行5 '端一扩反应，扩增体系为ddH2017.25u 1,10Xbuffer2.5u I, dNTP (IOmmolL-1) 0.5y I，MgC12 (25mmol L-1)1.5u 1，UMP (10 u mo I L-1) 0.5 u I, ICS5-1 (10 u mol L-1)0.5u 1,3' RACE cDNA0.5 u 1，Taq 酶(5Uii 1-1)0.25 u I,总体积 25 u I ;扩增程序为:94°C 2min，94°C lmin, 57°C lmin,72°C 2min，35 个循环，72°C延伸 IOmin ；
[0033]D、决明ICS基因cDNA的5'末端巢扩反应
[0034]使用5' RACE的基因特异引物ICS5-2与SMARTTMRACE试剂盒提供的3'末端巢扩引物ClontechNUP为引物对，以0.5 ill—扩产物作为模板，进行决明ICS基因的5'末端巢扩反应；反应体系和PCR扩增程序同一扩。
[0035]本发明的有益技术效果是:本发明方法首次获得决明SoICS基因的全序列，同时通过一种克隆决明SoICS基因的引物组和克隆方法，它能快速准确地克隆决明SoICS基因的全序列，为后续决明SoICS基因分子研究提供了理论基础。
【专利附图】
【附图说明】
[0036]图1是本发明的SoICS 3' -RACE末端扩增琼脂糖凝胶电泳；
[0037]图2是本发明的SoICS 5' -RACE末端扩增琼脂糖凝胶电泳；
[0038]图3是本发明的扩增CoICS基因全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳。【具体实施方式】
[0039]以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。
[0040]实施实例一
[0041]所用引物序列如下:
【权利要求】
1.决明SoICS基因，其特征在于:该基因核苷酸序列为SEQIDNO:1。
2.根据权利要求1所述决明SoICS基因，其特征在于:所述基因的编码区序列编码氨基酸为 SEQID NO:2。
3.用于克隆决明SoICS基因的引物组，其特征在于:所述引物组序列如下:
4.一种克隆决明SoICS基因的方法，其特征在于:包括如下步骤 步骤一、决明总RNA提取和反转录； 步骤二、3' -RACE 和 5' -RACE 扩增； 步骤三、决明ICS基因全长cDNA序列扩增； 步骤四、PCR产物的克隆纯化与筛选。
5.根据权利要求4所述的克隆决明SoICS基因的方法，其特征在于:所述步骤二中3' -RACE和5' -RACE扩增包括如下步骤: A、决明ICS基因cDNA的3'末端一扩反应 使用基因特异引物ICS3-1和GeneRacer Kit提供的GeneRacer3 ' P为引物对，用从各植物部位获得的cDNA的等量混合cDNA为模板，进行3 '末端一扩反应；扩增体系为 ddH2017.25ii 1，10Xbuffer2.1，dNTP(10mmol L-1)0.5u I, MgC12 (25mmol L-1).1.5u 1,3 ' P (10 u mo I L-1 )0.5 u I, ICS3-1 (10 u mol L_l) 0.5 ii 1，总 cDNA0.5 ii 1，Taq聚合酶(5Uii 1-1)0.25iil，总体积 25iil ;扩增程序为:94 °C 2min，94°C lmin，56°C lmin，.72°C lmin, 35 个循环，72°C延伸 IOmin ； B、决明ICS基因cDNA的3'末端巢扩反应 使用基因特异引物ICS3-2和GeneRacer Kit提供的物GeneRacer3' NP为引物对，以.0.5u 13/ -RACE 一扩产物作为模板，进行决明ICS基因的3'末端巢扩反应，反应体系和扩增程序同一扩； C、决明ICS基因cDNA的5'末端一扩反应 使用5' RACE基因特异引物ICS5-1与SMARTTMRACE试剂盒提供的引物ClontechUPM为引物对，用总cDNA为模板，进行5 '端一扩反应，扩增体系为ddH2017.25u I,.10 X buff er2.5 u l，dNTP (IOmmol L-1 )0.5 u I, MgCl 2 (25mmol L-l)l.5u I, UMP (IOu mo IL-1)0.5 u I, ICS5-l(10umol L-1)0.5u 1,3 ' RACE cDNA0.5 y 1，Taq 酶(5Uy 1-1).0.25 u 1，总体积 25ii I ;扩增程序为:94°C 2min，94°C lmin, 57°C lmin, 72°C 2min，35 个循环，72°C延伸 IOmin ；D、决明ICS基因cDNA的5'末端巢扩反应 使用5' RACE的基因特异引物ICS5-2与SMARTTMRACE试剂盒提供的3'末端巢扩引物ClontechNUP为引物对，以0.5 ill—扩产物作为模板，进行决明ICS基因的5'末端巢扩反应，反应体系和PCR扩增程序同一扩。
【文档编号】C12N15/61GK103602693SQ201310597789
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】李关荣, 艾义, 谭燕, 米瑶, 朱林蕙 申请人:西南大学