环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法
【专利摘要】一种环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，先将核酸杂交探针标记在芯片的表面，然后在LAMP反应体系下进行环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应，最后进行后续的放射性信号检测或是非放射性信号的化学显色检测。本发明提供的方法将环介导等温扩增过程和核酸杂交过程合并，缩短了反应时间，有效解决了传统的PCR扩增和核酸杂交时间过长的缺陷。
【专利说明】环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种生物纳米检测技术，尤其涉及一种环介导等温扩增技术和核酸杂交同步反应的方法，将环介导等温扩增过程、核酸杂交过程这两个分子生物学反应环节合二为一，缩短为一个反应步骤。
【背景技术】
[0002]环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)是 2000 年由日本科学家Notomi, T.首次在Nucleic Acids Research杂志上报道的一种新颖的恒温核酸扩增方法，之后又不断改进并于2008年在杂志Nature Protocols上对其技术要点进行了系统的归纳总结。环介导等温扩增技术的特点是针对靶基因的6个区域设计4种特异引物，利用一种链置换DNA聚合酶在等温条件(63°C左右)保温30 — 60分钟，即可完成核酸扩增反应。与常规PCR相比，不需要模板的热变性、温度循环、电泳及紫外观察等过程。环介导等温扩增法是一种全新的核酸扩增方法，具有简单、快速、特异性强的特点。该技术在灵敏度、特异性和检测范围等指标上能媲美甚至优于PCR技术，不依赖任何专门的仪器设备实现现场高通量快速检测，检测成本远低于荧光定量PCR。
[0003]经过十几年的发展，环介导等温扩增技术已成熟完备，并被广泛应用于病原微生物检测、食品安全、转基因物种检测、肿瘤诊断、胎儿性别鉴定、进出□快速诊断等多个领域，其检测结果的可靠性得到了普遍认可。
[0004]核酸杂交技术是一种分子生物学的成熟标准技术，用于检测核酸分子(DNA或RNA)的特定序列(靶序列)。先将核酸杂交探针(寡核苷酸序列)转移并固定到硝酸纤维素膜、尼龙膜、或基因芯片上，核酸样本靶序列在聚合酶链式反应(PCR)的过程中用放射性或非放射性物质标记，然后将核酸扩增产物与探针杂交。在杂交时，探针通过碱基互补配对原则与靶序列结合，洗去未结合的游离核酸片段后，经放射自显影或显色反应检测特异结合的核酸片段。`
[0005]无论是硝酸纤维素膜(或尼龙膜)上的核酸杂交反应，还是基因芯片上核酸杂交过程，都是先将核酸样品在PCR反应体系下扩增一个小时左右，再将PCR产物与核酸探针在杂交缓冲液中进行6小时或更长时间的杂交反应。很明显，这样的反应时间O 7小时)比较长，不太适合于快速诊断的要求。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于提供一种环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，将环介导等温扩增过程和核酸杂交过程合并的新方案，以解决传统的PCR扩增和核酸杂交时间过长的缺陷。
[0007]本发明的目的在于提供一种环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法在HBV检测的应用，将环介导等温扩增过程和核酸杂交过程合并的新方案，已解决传统的PCR扩增和核酸杂交时间过长的缺陷。[0008]本发明提供的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，包括
[0009]第一步:将核酸杂交探针标记在芯片的表面，
[0010]用无水甲苯稀释到1% (v/v)浓度的3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)在室温条件下处理芯片的表面(二氧化硅或玻璃)2小时，然后用无水甲苯清洗芯片洗表面3次；接着在预定的杂交探针修饰区域滴加1% (v/v)浓度的戊二醛水溶液，室温放置I小时后用水洗涤3次；随后将I μ L浓度为14 μ M核酸杂交探针滴加在修饰区域,封闭后放置室温I小时；接着在其表面滴加20mM甘氨酸水溶液，以封闭表面未与杂交探针发生反应的多余醛基，室温放置I小时，最后用超纯水清洗表面3次，晾干残余水分即得。
[0011]第二步:环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应，
[0012]将25 μ L如下LAMP反应体系液滴加在基因芯片的探针修饰区域，封闭后，将芯片放置在63°C的恒温箱中进行核酸扩增和核酸杂交，反应I小时之后用水清洗三次，去除未与探针杂交结合的LAMP产物。
[0013]LAMP反应体系液由如下成分组成:
【权利要求】
1.一种环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，其特征包括: 第一步:将核酸杂交探针标记在芯片的表面， 用无水甲苯稀释到lv/v%浓度的3-氨丙基三乙氧基硅烷在室温条件下处理芯片的表面2小时，然后用无水甲苯清洗芯片洗表面3次；接着在预定的杂交探针修饰区域滴加Iv/v%浓度的戊二醛水溶液,室温放置I小时后用水洗涤3次；随后将I μ L浓度为14 μ M核酸杂交探针滴加在修饰区域，封闭后放置室温I小时；接着在其表面滴加20mM甘氨酸水溶液，以封闭表面未与杂交探针发生反应的多余醛基，室温放置I小时，最后用超纯水清洗表面3次，晾干残余水分即得； 第二步:环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应， 将25μ L如下LAMP反应体系液滴加在基因芯片的探针修饰区域，封闭后，将芯片放置在63°C的恒温箱中进行核酸扩增和核酸杂交，反应I小时之后用水清洗三次，去除未与探针杂交结合的LAMP产物， LAMP反应体系液由如下成分组成:
2.根据权利要求1所述的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，其特征在于所述的核酸杂交探针为具有SEQ ID N0.1所示序列或其同源序列，并在该序列的5’端连接5’ -NH2-(T)15-的核酸序列。
3.根据权利要求1所述的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，其特征在于所述的B3为SEQ ID N0.2所示的序列或其同源序列。
4.根据权利要求1所述的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，其特征在于所述的F3为SEQ ID N0.3所示的序列或其同源序列。
5.根据权利要求1所述的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，其特征在于所述的BIP为SEQ ID N0.4所示的序列或其同源序列。
6.根据权利要求1所述的环介导等温扩增与核酸杂交的同步反应方法，其特征在于所述的FIP为在SEQ ID N0.5所示的序列或其同源序列的5’端连接生物素的核酸。
【文档编号】C12Q1/68GK103589804SQ201310597782
【公开日】2014年2月19日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】崔大祥, 郅晓, 邓敏 申请人:上海交通大学