一种氧化葡萄糖酸杆菌启动子及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种氧化葡萄糖酸杆菌启动子及其应用，所述启动子具有下列核苷酸序列：1）序列表中SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列；或2）在严谨条件下与SEQ?ID?NO：1所示的核苷酸序列进行杂交且具有启动子功能的核苷酸序列；或3）对1）或2）所限定的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所得的，与1）或2）所限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的核苷酸序列。本发明的启动子具有在氧化葡萄糖酸杆菌中有效表达内源或外源基因的功能，与常用启动子相比具有更高的启动活性，可实现在G.oxydans中应用于基因表达、功能基因的筛选研究，还可用于2-KGA高产基因工程菌的构建。
【专利说明】一种氧化葡萄糖酸杆菌启动子及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种启动子，更具体地涉及一种氧化葡萄糖酸杆菌启动子及其应用。【背景技术】
[0002]基因表达的最终产物是RNA和蛋白质，任何基因表达调控程序的缺陷或紊乱，均会对生物体造成严重后果。因此，基因表达调控的机理研究是分子生物学的热点和前沿。编码蛋白质基因的表达需要转录和翻译两个环节，每个环节都存在着不同的基因表达调控位点。启动子作为启动基因的重要元件已有详细研究。启动子是指可以与RNA聚合酶结合以起始转录的DNA序列区域，通常位于编码基因的上游。它是基因的一个组成部分，控制基因表达(转录)的起始时间和表达程度。因此，启动子的筛选和功能分析对于生物体内表达调控机制的研究以及实现目的基因的时空特异性表达具有十分重要的意义。使用强启动子有利于促进内源或外源基因的闻效表达。
[0003]氧化葡萄糖酸杆菌(G.0xydans)是一种革兰氏阴性菌，属于醋酸杆菌科(Acetobacterceae),其最大特点是细胞周质外膜空间含有许多膜结合脱氢酶,可以不完全氧化糖、糖醇等多种底物为醛、酮及酸，产物不需要通过透膜运输而直接分泌到胞外，因此广泛应用于工业生产。通过现代生物技术对微生物进行遗传标记和改良，是研究和阐明其在生物催化中的作用、实现菌株的靶向改造的重要手段。目前，已有少数研究者尝试筛选启动子来驱动内源基因在G.0xydans的高表达，以期构建高产工程菌。例如，Saito等人将来自于E.coli的三个启动子tufB、tac及PL用于强化L-山梨糖脱氢酶基因(sdh)和L-山梨糖酮脱氢酶基 因(sndh)在G.0xydans中的表达,使得产物2_酮基-葡萄糖酸(2-KGA)的生成量比对照菌有不同程度的提高，其中tufB启动子表现最高的启动活性，2-KGA的产量从对照的59mg/ml提高到88mg/ml，提高的幅度有限(Saito，Y.，Ishii1Y.,Hayashi, H.，Imaoj Y.，Akashij T.，Yoshikawaj K.，Noguchi, Y.，Soedaj S.，Yoshidaj Μ.，NiwajΜ.，(1997)Cloning of genes coding for L-sorbose and L-sorbosone dehydrogenasesfrom Gluconobacter oxydans and microbial production of 2-keto-L-gulonate,aprecursor of L—ascorbic acid, in a recombinant G.0xydans strain.Applied andenvironmental microbiology63, 454-460.)。Merfort 等人报道了来自于 G.0xydans的延长因子启动子tufB也能启动5-酮基-葡萄糖脱氢酶(ga5dh)的同源表达(Merfort, M., Jiilichj F., (2006)Untersuchungen zur 5-keto-D-Gluconat Bildung mitGluconobacter oxydans.Forschungszentrum Jiilich GmbH，Zentralbibliothek.)。总而言之，自身相应的遗传操作系统的缺乏仍旧是制约G.0xydans基因工程改良的主要因素，而获得能在G.0xydans中使用且高效的启动子是关键条件。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一种氧化葡萄糖酸杆菌启动子及其应用，从而解决氧化葡萄糖酸杆菌自身相应的遗传操作系统的缺乏制约了氧化葡萄糖酸杆菌基因工程的改良的缺陷。
[0005]为了解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案:
[0006]提供一种氧化葡萄糖酸杆菌启动子，所述氧化葡萄糖酸杆菌启动子具有下列核苷酸序列:1)序列表中SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列；或2)在严谨条件下与SEQ ID NO:I所示的核苷酸序列进行杂交且具有启动子功能的核苷酸序列；或3)对I)或2)所限定的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所得的，与I)或2)所限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的核苷酸序列。
[0007]所述杂交是在以下条件中进行:在2X SSC, 0.P/oSDS的溶液中，68°C下杂交并洗膜I次，每次5min ;或在0.5X SSC, 0.1%SDS的溶液中，68°C下杂交并洗膜2次，每次15min。
[0008]还提供如上所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子的应用，所述氧化葡萄糖酸杆菌启动子在氧化葡萄糖酸杆菌中能够有效表达内源基因或外源基因。
[0009]所述内 源基因包括来源于氧化葡萄糖酸杆菌的NADH脱氢酶II基因以及GA2DH基因，所述外源基因包括GFP基因。
[0010]所述氧化葡萄糖酸杆菌启动子在氧化葡萄糖酸杆菌中对GA2DH基因的有效表达可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高产基因工程菌的构建。
[0011]还提供一种重组载体，所述重组载体中含有如上所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子，所述重组载体通过在载体质粒的多克隆位点插入具有所述核苷酸序列的DNA片段获得。
[0012]还提供一种表达盒，所述表达盒中含有如上所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子，由所述核苷酸序列启动表达的目的基因，以及终止所述目的基因转录的终止序列组成。
[0013]还提供一种转基因细胞系，所述转基因细胞系含有如上所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子。
[0014]还提供一种重组菌，所述重组菌含有如上所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子。
[0015]本发明提供的氧化葡萄糖酸杆菌启动子经证明具有在氧化葡萄糖酸杆菌中有效表达内源基因或外源基因的功能，与该氧化葡萄糖酸杆菌中常用的启动子tufB的作用效果相比，本发明提供的启动子gHp0169具有更高的启动活性,可实现在G.0xydans中应用于基因表达、功能基因的筛选研究，并且该氧化葡萄糖酸杆菌启动子还可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高产基因工程菌的构建。
【专利附图】
【附图说明】
[0016]图1为PCR扩增得到的gHp0169启动子的电泳图谱；其中，泳道I为引物gHp0169-F和gHp0169-R扩增得到的gHp0169启动子的电泳图谱；泳道M为DNA Maker,分子标准从小到大依次为 200bp，500bp，800bp，1200bp, 2000bp, 3000bp, 4500bp ；
[0017]图2为gHp0169启动子在G.0xydans基因组上的定位；其中，G0X0168为编码一个NAD依赖的DNA连接酶基因，GOXO169编码一个假定的蛋白。
[0018]图3为PCR扩增得到的gfp的电泳图谱。其中泳道I和2都为gfp_F和gfp-R扩增得到的gfp的电泳图谱；泳道M为DNA Maker，分子标准从小到大依次为200bp，500bp，800bp，1200bp，2000bp，3000bp，4500bp ；
[0019]图4为gHp0169启动子驱动的GFP蛋白在G.0xydans中随着菌体生长的荧光值变化；
[0020]图5为G.0xydans中GFP蛋白在突光显微共聚焦显微镜下的突光照片；其中，a为gHp0169启动子驱动下的G.0xydans, b为含空载pBBRlMCS5的对照菌；
[0021]图6为PCR扩增得到的tufB的电泳图谱；其中，泳道I为tufB_F和tufB_R扩增得到的tufB的电泳图谱；泳道M为DNA Maker，分子标准从小到大依次为200bp，500bp，800bp,1200bp,2000bp,3000bp,4500bp ；
[0022]图7为PCR扩增得到的ndh的电泳图谱；其中，泳道I为ndh_F和ndh_R扩增得到的ndh的电泳图谱；泳道M为DNA Maker,分子标准从小到大依次为200bp，500bp,800bp,1200bp,2000bp,3000bp,4500bp ；
[0023]图8为PCR扩增得到的ga2dh的电泳图谱；其中，泳道I为ga2dh_F和ga2dh_R扩增得到的ga2dh的电泳图谱；泳道11为DNA Maker，分子标准从小到大依次为200bp，500bp，800bp,1200bp,2000bp,3000bp,4500bp ； [0024]图9为ga2dh基因在各个菌中的转录水平比较；
[0025]图10为各菌以氧化葡萄糖酸(GA)为底物生产2-酮基-D-葡萄糖酸(2KGA)的过程比较。
【具体实施方式】
[0026]以下结合具体实施例，对本发明做进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限制本发明的范围。
[0027]下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，参照《分子克隆指南》(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述条件。
[0028]下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0029]菌株与质粒:大肠杆菌(E.coli)DH5a购自东盛公司。
[0030]pBBRlMCS5:参考 Kovach, Μ.E.，Elzer, P.H.，Steven Hill, D., Robertson, G.T., Farris, Μ.A., Roop II, R.Μ., Peterson, K.Μ., (1995) Four new derivativesof the broad-host-range cloning vector pBBRlMCS, carrying differentantibiotic-resistance cassettes.Genel66, 175—176。
[0031 ] 工具酶及生化试剂:各限制性内切酶购自Fermentas公司；T4DNA连接酶、T-Vector pMD?19(Simple)购自 Takara 公司；2XPCR mix 购自东盛公司；卡那霉素(Kan)、头孢西丁钠霉素(Cef)、硫酸庆大霉素(Gen)购自上海生工生物工程公司。
[0032]培养基:下述培养基的溶剂均为水。
[0033]LB液体培养基(I升):10g NaCl，5g酵母提取物，IOg胰蛋白胨。
[0034]LB固体培养基(I升):I升液体LB液体培养基加13g琼脂。
[0035]山梨醇液体培养基(I升):80g山梨醇，20g酵母提取物，Ig KH2PO4,0.5gMgSO4.7Η20，0.Ig 谷氨酰胺。
[0036]山梨醇固体培养基(I升):1升液体山梨醇液体培养基加13g琼脂。
[0037]本发明中，静息细胞是指在生长培养基上培养至一定时间后的微生物细胞，用适当的方法收集并用缓冲液进行洗涤，去除营养成分的微生物细胞。
[0038]实施例1:启动子gHp0169的克隆[0039]根据G.0xydans621H基因组序列，gHp0169序列位于G0X0168和G0X0169之间(如图2所示)，设计与合成引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，其序列如下:
[0040]gHp0169-F:5， -ATAGAGCTCGCCAAGAAAGCCGCAGAACTC-3，；
[0041]gHp0169-R:5’ ~GCATCTAGAGCGGAAGGCGTTATACCCTGA~3J ；
[0042]以G.0xydans的基因组为模板，以gHp0169_F和gHp0169_R为引物，PCR扩增目的基因，并在两端分别引入Sac I和Xba I酶切位点(下划线所示)，具体条件如下:
[0043]反应体系:2XPCRmix25y 1，引物(10 μ mol/L)各 I μ 1，模板 I μ 1，ddH2022 μ I ；
[0044]反应过程:94°C5min，94°C 30s,60°C 30s，72°C 30s，30 个循环，72°C延伸 lOmin，
4°C保存。
[0045]结果如图1所示，采用引物gHp0169-F和gHp0169_R扩增得到大小约150bp的目
的条带。
[0046]将扩增条带回收纯化后连接到T-Vector pMD?19 (Simple)载体上,得到重组载体命名为T-gHp0169。对插入片段进行测序。测序结果表明与gHp0169的5’侧翼序列比较，一致性为100%，表明扩增正确。将该片段命名为gHp0169，其具体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1 所示。
[0047]实施例2:启动子gHp0169的功能活性验证
[0048]2.1、质粒 pBBRlpgHp0169_GFP 的构建
[0049]根据引物gHpO 169-F和gHpO 169-R两端设计的酶切位点，用Sac I和XbaI将gHp0169片段从实施例1构建所得的T-gHp0169重组载体上切下，把酶切后回收的gHp0169片段与经Sac I和Xba I酶切的pBBRlMCS5载体片段连接。将连接产物转化到大肠杆菌DH5a菌株中，提取质粒，用Sac I和Xba I酶切鉴定。对初步鉴定正确的重组质粒进行测序，将测序表明含有SEQ ID NO:1所示的142bp的重组载体命名为pBBRlpgHp0169。
[0050]以PET28a_GFP (购自美国绿阳生物医药公司)为模板，设计与合成gfp引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，其序列如下:
[0051]GFP-F:ACGTCTAGAAGAAAGACGATGGCTAGCA
[0052]GFP-R: CGCGGATCCTTATTTGTACAGTTCATCCA
[0053]以质粒PET28a_GFP为模板，以GFP-F和GFP-R为引物，PCR扩增目的基因，并在两端分别引入Xba I和BamH I酶切位点(下划线所示)，具体条件如下:
[0054]反应体系:2XPCRmix25y 1，引物(10 μ mol/L)各 I μ 1，模板 I μ 1，ddH2022 μ I ；
[0055]反应过程:94°C5min，94°C 30s, 58°C 30s, 72°C lmin，30 个循环，72°C延伸 lOmin，4°C保存。
[0056]将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在720bp左右存在明显条带，如图3所示。用胶回收试剂盒纯化回收720bp左右的片段后，用Xba I和BamHI限制性内切酶于37°C水浴酶切lh，再次电泳胶回收，与同样酶切的质粒pBBRlpgHp0169连接，转化，重组质粒经双酶切、PCR后进行电泳(有大小约为720bp的酶切目的条带)进行测序，将测序表明含有GFP的重组载体命名为pBBRlpgHp0169-GFP。
[0057]2.2、氧化葡萄糖酸杆菌的基因工程菌G.0xydans pBBRlpgHp0169_GFP的获得。
[0058]将2.1中获得的重 组质粒pBBRlpgHp0169_GFP先转化至大肠杆菌(E.coli)进行扩增，然后从重组E.coli提取质粒pBBRlpgHp0169-GFP,用电转化方法转化至G.0xydans,转化液在30°C摇床复苏3-4h，涂布至含有硫酸庆大霉素(25mg/ml)的山梨醇琼脂平板上，于30°C培养2-3天后，长出的抗性菌落即为阳性转化子。同时转化空质粒PBBR1MCS5于G.0xydans,得到 G.0xydans pBBRlMCS5 作为空白对照。
[0059]2.3、GFP在G.0xydans中表达量的检测
[0060]全细胞相对突光定量检测根据Yuzhou Xu, Qin Liu, Lingyun Zhou, ZhaoYang, Yuanxing Zhang.Surface Display of GFP by Pseudomonas Syringae TruncatedIce Nucleation Protein in Attenuated Vibrio Angui Ilarum Strain.MarBiotechnol (2008) 10:701 - 70所述，将各个时间点取的菌用PBS稀释至0D600为1.0，利用突光酶标仪(GENios Pro, Tecan, Mammedorf, Auich, Switzerland)在激发波长 485nm 和激发波长535nm下定量相对荧光。对照菌经过同一处理后将其相对荧光作为对照。利用荧光扫描共聚焦显微镜(CLSM，尼康，日本东京)观察菌体荧光表达情况。
[0061]从图4可以看出，全细胞荧光值随着菌体生长增长，当在稳定期时达到最大，因此我们取24h的菌体用于荧光显微共聚焦扫描，从图5可以看出，GFP在gHp0169的驱动下得到了表达，而对照菌则无荧光表达。
[0062]2.4、质粒 pBBRlpgHp0169_ndh 和 pBBRlptufB-ndh 的构建
[0063]根据氧化葡萄糖酸杆菌G.0xydans的启动子tufB的核苷酸序列,其具体的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:2所示，设计引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，序列如下:
[0064]PtufB-F:5，-ACTGAGCTCCGATGGTAAGAAATCCACTGC-3，；
[0065]PtufB-R:5，-ATATCTAGACCAAAACCCCGCTCCACC-3，；
[0066]以G.0xydans菌株基因组为模板，以PtufB-F和PtufB-R为引物PCR扩增，在启动子序列两端分别引入Sac I和Xba I酶切位点，扩增条件如下:
[0067]反应体系:2XPCRmix25y 1，引物(10 μ mol/L)各 I μ 1，模板 I μ 1，ddH2022 μ I ；
[0068]反应过程:94°C 5min，94°C 30s,60°C 30s，72°C 40s，30 个循环，72°C延伸 lOmin，
4°C保存。
[0069]PCR产物得到的tufB片段(如图6，约500bp)用Sac I和Xba I酶切，把酶切后回收的tufB片段与经Sac I和Xba I酶切的pBBRlMCS5载体片段连接。将连接产物转化到大肠杆菌DH5a菌株中，提取质粒，用Sac I和Xba I酶切鉴定。对初步鉴定正确的重组质粒进行测序，将重组载体命名为pBBRlptufB。
[0070]根据氧化葡萄糖酸杆菌G.0xydans的ndh的核苷酸序列,设计引物(上海捷瑞生物工程有限公司)，序列如下:
[0071]ndh-F:5’ ~CGTCTAGAGAGGAAAAATCCATGTCTGC~3J ；
[0072]ndh-R:5’ ~ATAGGATCCATGCTCAAGCAGAGGACG~3，；
[0073]以G.0xydans的基因组为模板，以ndh_F和ndh_R为引物进行PCR扩增，在启动子序列两端分别引入Sac I和Xba I酶切位点(下划线所示)，扩增条件如下:
[0074]反应体系:2XPCRmix25y 1，引物(10 μ mol/L)各 I μ 1，模板 I μ 1，ddH2022 μ I ；
[0075]反应过程:94°C5min，94°C 30s,60°C 30s，72°C 40s，30 个循环，72°C延伸 lOmin，4°C保存。
[0076]将获得的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，在1400bp左右存在明显条带(图7)。用胶回收试剂盒纯化回收HOObp左右的片段后，用Xba I和BamH I限制性内切酶于37°C水浴酶切Ih，再次电泳胶回收，与同样酶切的质粒pBBRlpgHp0169/pBBRlptufB连接，转化，重组质粒经双酶切、PCR后进行电泳(有大小约为1400bp的酶切目的条带)进行测序，将测序表明含有GFP的重组载体命名为pBBRlpgHp0169-ndh/pBBRlptufB-ndh。
[0077]2.5、NDH II的酶活检测
[0078]膜组分的提取:将G.0xydans培养至稳定期后收集，1000Orpm离心IOmin,做的菌体用一定体积的水洗涤一次，再用pH7.5,20mM的PBS缓冲液洗涤两次后，重悬于同样的缓冲液中。将细菌液于冰浴中超声破碎(超5s停5s，99次)，然后于4°C、1000Orpm离心lOmin，弃沉淀取上清于4°C、30000rpm超声离心lh，所得沉淀用50mM、pH5.5的NaAc缓冲液溶解，所得即为膜组分。
[0079]酶活测定:利用分光光度计在30°C、340nm处扫描因NADH还原为NAD+引起的吸光值变化。反应体系(Iml):0.1mMNADH, 40mM的辅酶Q2 (溶解于二甲基亚砜中)、50mM、pH7.5的PBS以及适量的酶。反应混合物现在30°C温浴3min，然后加底物。蛋白浓度的测定用Bradford 法。
[0080]如表1结果所述，gHp0169驱动下的NDH II酶活为2.47U/mg,远远高于对照菌(0.97U/mg),而同时在G.0xydans普遍使用的启动子tufB控制下酶活也仅为1.39U/mg,说明启动子gHp0169适用于在G.0xydans启动外源基因和内源基因的表达。
[0081]表1:NDH II在不同启动子驱动下的酶活差别
[0082]
【权利要求】
1.一种氧化葡萄糖酸杆菌启动子，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌启动子具有下列核苷酸序列: 1)序列表中SEQID NO:1所示的核苷酸序列；或 2)在严谨条件下与SEQID NO:1所示的核苷酸序列进行杂交且具有启动子功能的核苷酸序列；或 3)对I)或2)所限定的核苷酸序列进行一个或多个碱基的取代、缺失、插入或添加所得的，与I)或2)所限定的核苷酸序列具有90%以上同源性且具有启动子功能的核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子，其特征在于，所述杂交是在以下条件中进行:在2XSSC，0.1%SDS的溶液中，68°C下杂交并洗膜I次，每次5min ;或在0.5X SSC, 0.1%SDS的溶液中，68°C下杂交并洗膜2次，每次15min。
3.一种根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子的应用，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌启动子在 氧化葡萄糖酸杆菌中能够有效表达内源基因或外源基因。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述内源基因包括来源于氧化葡萄糖酸杆菌的NADH脱氢酶II基因以及GA2DH基因，所述外源基因包括GFP基因。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述氧化葡萄糖酸杆菌启动子在氧化葡萄糖酸杆菌中对GA2DH基因的有效表达可用于2-酮基-D-葡萄糖酸高产基因工程菌的构建。
6.一种重组载体，其特征在于，所述重组载体中含有根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子，所述重组载体通过在载体质粒的多克隆位点插入具有所述核苷酸序列的DNA片段获得。
7.—种表达盒，其特征在于，所述表达盒中含有根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子，由所述核苷酸序列启动表达的目的基因，以及终止所述目的基因转录的终止序列组成。
8.—种转基因细胞系，其特征在于，所述转基因细胞系含有根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子。
9.一种重组菌，其特征在于，所述重组菌含有根据权利要求1所述的氧化葡萄糖酸杆菌启动子。
【文档编号】C12R1/01GK103740714SQ201310597667
【公开日】2014年4月23日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】林金萍, 魏东芝, 施露露 申请人:华东理工大学