产糖苷酶的链霉菌及其在生物转化制备葫芦素b中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明提供了一株糖苷酶产生菌——链霉菌（Streptomyces?sp.）RW-2，及其在生物转化葫芦素B-2-O-葡萄糖苷制备葫芦素B中的应用。该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国，武汉，武汉大学，邮编：430072，保藏编号：CCTCC?No：M2013330，保藏日期2013年7月17日。本发明的有益效果主要体现在：（1）链霉菌是发酵工业中常用菌种，无毒无害，使用安全；（2）链霉菌RW-2营养要求简单、生长迅速、容易培养；（3）链霉菌RW-2产生的糖苷酶为胞外酶，分离除去菌体，粗酶液或经稀释后，即可作为生物转化体系，（4）从甜瓜蒂提取的总葫芦素经生物转化处理后，其中的葫芦素B-2-O-葡萄糖苷几乎能全部转化为葫芦素B，葫芦素B的含量可提高1～2.7倍。
【专利说明】产糖苷酶的链霉菌及其在生物转化制备葫芦素B中的应用
(一)【技术领域】
[0001]本发明涉及一株产糖苷酶的链霉菌及其在生物转化制备葫芦素B中的应用。
(二)【背景技术】
[0002]甜瓜蒂为葫芦科一年生草质藤本植物甜瓜(Cucumis melo)成熟后的干燥果柄，别名也叫瓜蒂、瓜丁、苦丁香，始载于《神农本草经》，为上品之药，系《中国药典》一部1977年版收载品种，味苦，性寒，入脾、胃经。具有涌吐痰食、祛湿退黄之功。现代临床多用于治疗食积不化，食物中毒，癫痫痰盛以及急、慢性肝炎和肝硬化等。
[0003]甜瓜蒂的药效成分为葫芦素(cucurbitacins)，葫芦素是一类四环三萜类化合物，现已发现40余种，如葫芦素B、葫芦素D和葫芦素E等，它们具有护肝消炎和抗肿瘤等多种生物学活性。在甜瓜蒂中，葫芦素B占总葫芦素的比例最高，并且活性最好，是抗肝炎、肝癌的最有效单体，对因湿热毒盛所致迁延性肝炎、慢性肝炎及原发性肝癌有很好的辅助治疗效果。
[0004]上世纪70~80年代，国内已研发出药物葫芦素片，临床用于肝炎和原发性肝癌的辅助治疗。葫芦素片是用乙醇从甜瓜蒂提取的总葫芦素经纯化后加辅料压片而成，葫芦素B是主要药效成分，也是该药品有效成分检验的指标，药典要求其含量不低于60%。
[0005]从甜瓜蒂提取的总葫芦素中存在葫芦素B-2-0-葡萄糖苷(以下简称为葫芦素B糖苷)，其含量接近甚至大于葫芦素B的含量，但生物活性远远不如葫芦素B，如对人肝癌HepG-2细胞的抑制作用的仅为葫芦素B的1.1%。糖苷键连接的化合物需先经过代谢转化为苷元才能被人体吸收，但由于人体缺乏相应的酶而水解困难，几乎不能被人体吸收。
(三)
【发明内容】
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[0006]本发明目的是提供一株糖苷酶产生菌-链霉菌(Streptomyces sp.)RW_2,及其
在生物转化制备葫芦素B糖苷中的应用，能够显著提高从甜瓜蒂提取的总葫芦素中葫芦素B含量，具有成本低、工艺简单、效率高等优点。
[0007]本发明采用的技术方案是:
[0008]链霉菌(Sti^ptomyces sp.) RW-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，邮编:430072，保藏编号=CCTCC No:M2013330，保藏日期2013年7月11日。
[0009]本发明所述链霉菌RW-2，是由河道污水与甜瓜蒂粉末混合富集培养物中分离和筛选得到的优良菌株，再经紫外线照射诱变处理获得。
[0010]所述链霉菌RW-2的菌落特征如下:在平板培养基上，30°C条件下，培养3天，菌落初期为白色，小而致密、干而不透明，不易挑起，之后逐渐变大，呈灰绿色，表面呈粉状，有褶皱，背面呈灰黑色。在显微镜下观察，基内菌丝细长，多分枝；直径为0.8~1.0 ii m ;气生菌丝略粗；分生孢子呈椭圆形，表面光滑。
[0011]所述链霉菌RW-2的16s rDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示:
[0012]GCTTACCATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGAGCCACTTGGGCATCCAA
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CAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGACGAAGTCGAACAAo[0013]本发明还涉及所述的链霉菌RW-2在微生物发酵制备糖苷酶中的应用。[0014]具体的，所述应用如下:将链霉菌RW-2菌种孢子或经过扩大培养的种子接种至产酶培养基中，25~35°C培养3~6天，获得含有糖苷酶的发酵液。所得发酵液经过滤或离心除去菌体的清液为糖苷酶粗酶液，可以直接应用于生物转化葫芦素B糖苷；也可以保藏于4°C冰箱15天内使用；也可以经过冷冻干燥，制成粗酶粉保藏于4°C冰箱长期使用。[0015]所述产酶培养基组成如下:马铃薯100~200g/L、蔗糖20~50g/L，大豆粉10~20g/L，溶剂为水，pH6.0 ~8.0。[0016]本发明还涉及所述的链霉菌RW-2在微生物转化葫芦素B糖苷制备葫芦素B中的应用，可提高甜瓜蒂乙醇提取的总葫芦素中葫芦素B含量。[0017]具体的，所述应用为:将链霉菌RW-2菌种孢子或经过扩大培养的种子液接种至产酶培养基中，25~35°C培养3~6天，发酵液经离心除去菌体获得糖苷酶粗酶液，粗酶液经1~5倍水稀释后，加入5~20%体积百分数的甜瓜蒂乙醇提取的总葫芦素溶液(其中葫芦素B含量为I~2mg/mL)，于25~35°C、150~250r/min振荡条件下进行转化12~48h，转化液经乙酸乙酯萃取回收总葫芦素。[0018]所述产酶培养基组成如下:马铃薯100~200g/L、蔗糖20~50g/L，大豆粉10~20g/L，溶剂为水，pH6.0 ~8.0。[0019]所述菌株在产酶培养前，通常需要先经斜面培养基活化培养，或经过种子扩大培养，然后用孢子或种子液接入产酶培养基进行产酶培养。[0020]具体的，所述活化、种子扩大培养及产酶培养方法如下:[0021](1)将链霉菌RW-2菌种孢子接种于斜面培养基，于25~35°C恒温培养箱中培养2~3天，得到活化后的链霉菌RW-2菌种；所述的斜面培养基组成为:马铃薯100~200g/L(马铃薯洗净去皮，切成小块，加5倍质量水煮沸20~30min，4层纱布过滤去除马铃薯块)、蔗糖10~20g/L、琼脂15~20g/L，溶剂为水，pH6.0~8.0，高压蒸汽121°C灭菌20min ；
[0022](2)将步骤(1)活化培养后链霉菌RW-2斜面孢子接种至种子培养基中，于25~35°C、150~250r/min振荡条件下培养I~2天，得到种子液；所述种子培养基不含琼脂，其他成分以及配制方法同斜面培养基；
[0023](3)将步骤(1)的链霉菌RW-2斜面孢子，或步骤(2)制备的种子液接入产酶培养基，产酶培养基于25~35°C、150~250r/min振荡条件下培养3~6天，得到链霉菌RW_2的发酵液；所述产酶培养基组成为:马铃薯100~200g/L (处理方法同斜面培养基)、蔗糖20~50g/L，大豆粉10~20g/L，溶剂为水，pH6.0~8.0，高压蒸汽121°C灭菌20min。
[0024]微生物有着非常强大的酶系和分解转化物质的能力，一些糖苷酶能将葫芦素B糖苷的葡萄糖残基水解而使其转化为葫芦素B。酶水解法比酸碱水解法更有专一性，不会对产物葫芦素B结构造成破坏，具有转化率高、条件温和等优点。本发明将甜瓜蒂提取的总葫芦素，用微生物发酵制备的特异性糖苷酶进行水解处理，将葫芦素B糖苷转化为葫芦素B，但对葫芦素B和葫芦素E等成分不产生水解作用，提高葫芦素B在总葫芦素中的含量，从而提高了该药品的有效成分含量，降低药品的生产成本。
[0025]本发明的有益效果主要体现在:(I)链霉菌是发酵工业中常用菌种，无毒无害，使用安全；(2)链霉菌RW-2营养要求简单、生长迅速、容易培养；(3)链霉菌RW-2产生的糖苷酶为胞外酶，分离除去菌体，粗酶液或经稀释后，即可作为生物转化体系，(4)从甜瓜蒂提取的总葫芦素经生物转化处理后 ，其中的葫芦素B糖苷几乎能全部转化为葫芦素B，葫芦素B的含量可提高I~2.7倍。
(四)【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为标准品葫芦素B (浓度为0.2g/L)高效液相色谱图；
[0027]图2为未经生物转化处理的总葫芦素的高效液相色谱图；
[0028]图3为经生物转化处理的总葫芦素的高效液相色谱图。
(五)【具体实施方式】
[0029]下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此:
[0030]实施例1:产糖苷酶微生物的富集、分离、筛选和诱变
[0031]250mL三角瓶中加入约2g甜瓜蒂，加适量河道中的污水，搅拌均匀，置于30°C的恒温箱培养7天，进行产糖苷酶微生物的富集。
[0032]将长满菌丝的上述富集物用无菌水稀释后涂布于平板培养基上，于30°C的生化培养箱中培养3天。挑取形态和颜色不同的菌落孢子接种于斜面培养基上，斜面置于30°C恒温培养3天，得孢子丰富的斜面菌种。
[0033]用接种环分别挑取上述各个菌株斜面菌种的孢子，接入50mL产酶培养基中(250mL三角瓶装)，于28°C、180r/min振荡条件下发酵培养5天后，将发酵液用4层纱布过滤，取9mL滤液(即粗酶液)转入一只50mL的三角瓶中，加入ImL甜瓜蒂乙醇提取的总葫芦素溶液(其中葫芦素B含量为1.42g/L)。三角瓶于28°C、180r/min的水浴振荡箱中生物转化24h后，用IOmL的乙酸乙酯萃取2遍，合并乙酸乙酯，减压蒸干后用IOmL甲醇溶解，0.45 u m滤膜过滤，用作葫芦素B含量分析。
[0034]高效液相色谱法分析经生物转化处理的总葫芦素中葫芦素B含量，由此比较不同菌株所产糖苷酶将葫芦素B糖苷转化为葫芦素B的能力大小，经过比较，一个编号为R-2的菌株所产糖苷酶将葫芦素B糖苷转化为葫芦素的转化率最高，葫芦素B含量可以提高1.43倍。
[0035]依据R-2的菌株菌落形态、菌丝大小和孢子形态初步判断为放线菌，采用16SrDNA序列分析方法对菌株R-2进行鉴定,确定其为一株链霉菌(Streptomyces sp.)。
[0036]对野生菌株链霉菌R-2进行了紫外照射诱变选育，经过筛选获得产酶转化葫芦素B糖苷为葫芦素B能力有所提高的菌株RW-2，葫芦素B含量可以提高1.86倍，较用野生菌株转化提高了 30.1%，将该菌株提交中国典型培养物保藏中心保藏，编号=CCTCC No:M2013330，保藏日期:2013年7月11日。
[0037]所述的平板培养基和斜面培养基的组成相同，按如下组成和方法配制:马铃薯洗净去皮，切成小块，称取200g，加自来水1000mL煮沸30min，4层纱布过滤去除马铃薯块，滤液补足到lOOOmL，再加入蔗糖20g、琼脂18g，pH自然，加热溶化后分装试管，高压蒸汽121°C灭菌20min。
[0038]所述的产酶培养基按如下组成配制:马铃薯200g/L (处理方法同平板培养基)、蔗糖20g/L，大豆粉10g/L，溶剂为水，pH自然(实测值为6.8)。
[0039]实施例2:用于生物转化过程的糖苷酶发酵
[0040]以链霉菌RW-2为 产酶菌种，经过培养基组成和发酵条件优化后，转化葫芦素B糖苷为葫芦素B的能力较未优化前显著提高，葫芦素B含量可以提高2.71倍，较未优化前提高了 45.7%，优选的制备方法如下:
[0041](I)将试管斜面保藏的链霉菌RW-2菌种接种于斜面培养基，斜面于30°C生化培养箱中培养3天。所述的斜面培养基按如下组成和方法配制:马铃薯洗净去皮，切成小块，称取200g，加自来水1000mL煮沸30min，4层纱布滤去马铃薯块，滤液补足到lOOOmL，再加入蔗糖20g、琼脂18g，pH自然，加热溶化后分装试管，高压蒸汽121°C灭菌20min。
[0042](2)用接种环挑取步骤(1)活化培养后的链霉菌RW-2孢子至产酶培养基中，于280C、180r/min振荡条件下培养5天，得到含糖苷酶的发酵液；所述产酶培养基按如下组成配制:马铃薯200g/L、蔗糖30g/L，大豆粉14g/L，溶剂为水，pH7.5。
[0043](3)将步骤(2)链霉菌RW-2的发酵液，用4层纱布过滤除去菌体，所得清液即为糖苷酶粗酶液。
[0044]所得糖苷酶粗酶液可以用于生物转化法提高总葫芦素中葫芦素B含量，可以立即使用，也可以保藏于4°C冰箱15天内使用，也可以经过冷冻干燥后制备酶干粉，保藏于4°C冰箱长期保藏使用。
[0045]实施例3:生物转化法提高总葫芦素中葫芦素B的含量
[0046]将市售中药材甜瓜蒂于85°C的烘箱中烘干24h，用粉碎机将其粉碎。IOg甜瓜蒂粉中加入200mL的70%乙醇，40°C水浴浸提2.5h，再超声浸提0.5h，4层纱布过滤，收集滤液。滤液减压蒸干后用40mL甲醇溶解，即得总葫芦素溶液(葫芦素B含量为1.68g/L)。
[0047]取实施例2中制备的糖苷酶粗酶液9mL于50mL三角瓶中，加入ImL的上述总葫芦素溶液，三角瓶用保鲜膜封口后，于32°C、180r/min的水浴振荡箱中生物转化16h。转化液用IOmL乙酸乙酯萃取2遍，合并乙酸乙酯，减压蒸干乙酸乙酯即得经生物转化处理的总葫
芦素产品。
[0048]实施例4:经生物转化法处理的总葫芦素中葫芦素B的含量分析
[0049]将实施例3中经生物转化处理的总葫芦素样品用IOmL甲醇溶解，0.45 U m滤膜过滤，采用高效液相色谱法分析其中葫芦素B的含量，结果表明，经生物转化处理的总葫芦素中，葫芦素B含量达到0.46g/L,而未经生物转化处理对照品中葫芦素B含量仅为0.17g/L,可见，经生物转化处理后， 葫芦素B含量提高2.71倍。
【权利要求】
1.链霉菌(Sti^ptomycessp.) RW-2，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址:中国，武汉，武汉大学，邮编:430072，保藏编号=CCTCC No:M2013330，保藏日期2013年7月11日。
2.如权利要求1所述的链霉菌RW-2，其特征在于所述链霉菌RW-2的16srDNA的部分核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.权利要求1所述的链霉菌RW-2在微生物发酵制备糖苷酶中的应用。
4.权利要求 1所述的链霉菌RW-2在生物转化葫芦素B-2-0-葡萄糖苷制备葫芦素B中的应用。
【文档编号】C12P33/00GK103614322SQ201310597855
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2013年11月22日 优先权日:2013年11月22日
【发明者】梅建凤, 李莎, 金航, 应国清, 王鸿, 易喻, 陈建澍 申请人:浙江工业大学