专利名称：一种高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法
技术领域：
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法。
背景技术：
大豆过氧化物酶(SBP)与辣根过氧化物酶同属于以血红素为辅基的III类过氧化物酶(EC1. 11. 117)，结构和功能非常相似。目前辣根过氧化物酶已经作为一种商品化试剂广泛用于免疫测定技术、电镜技术、酶联反应和免疫印迹等生物学研究，同时在生物传感
器、木素降解、工业“三废”处理等方面也有应用，所以大豆过氧化物酶同样有着广泛的应用前景。同时大豆过氧化物酶所具有的底物作用范围广、耐热性能高、酸碱稳定性好、PH适用范围宽等优点是辣根过氧化物酶不可比拟的，所以大豆过氧化物酶很可能会成为辣根过氧化物酶一个最有竞争力的替代品，成为过氧化物酶的一个很好的来源。对大豆过氧化物酶的研究可以追溯到1981年DvadiJ. Sesas和Robert LAndero的纯化和简单性质的研究。但直到上世纪九十年代中期开始，人们对SBP的研究才逐渐重视起来。1997年美国的Ameriena Qualex和Enzymol International公司将SBP应用于医药诊断试剂盒生产，用于诊断病毒、细菌、寄生所引起的疾病，包括AIDS和疟疾。SBP-试剂盒的性能和质量均高于传统的HRP-试剂盒，其常温下存储期超过一年，远高于HRP的4个月。1999年Pieree Chemieal公司出售马来酞亚胺活化的大豆过氧化物酶(EZ-Likn TMMaleimide Aetivated Soybean peroxidase)用于诊断试剂。活化的SBP在与抗体结合时只需要一步反应就能制备高质量的酶结合物，大大方便了 SBP在各种诊断试剂中应用的研究。Caza等人通过实验发现SBP能有效去除污水中几种不同的酹类化合物，当pH=7. O, SBP在PEG的作用下能去除污水中95%多的酚类化合物，这个性质极大弥补了传统污水处理中活性泥不能去除有毒物质及选择性不高的缺点。Kostic把SBP装在特殊处理的多孔玻璃板中进行污水处理，不仅解决了 SBP不能重复使用的缺陷，且加强了 SBP的选择性。现在美国环保部门己经应用SBP来处理工业废水。大豆过氧化物酶作为天然酶蛋白，其催化效率、底物亲合性、稳定性等酶学性质均有待进一步提高。利用分子进化的手段对大豆过氧化物酶基因、sbp)进行改造，改善其酶学性质，可以更好地适应工业应用要求。易错PCR以其操作简便、有效等优点成为目前应用最为广泛的进化手段之一。在酵母中实现分泌表达或在大肠杆菌中进行融合表达是基因工程生产的两种主要策略。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，它最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活体形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。巴斯德毕赤酵母(Pichia pastor is)是近几年发展起来的较为完善的、被广泛用来表达外源蛋白的甲醇营养型酵母表达系统。它不但克服了大肠杆菌表达系统不能表达结构复杂的蛋白、表达的蛋白多形成不溶性包涵体、背景蛋白多、表达产量低等缺陷；而且弥补了哺乳类细胞、昆虫细胞表达系统操作复杂，表达水平低，产业化生产造价昂贵的不足；与其他酵母表达系统相比，具有表达量高、稳定性好、培养成本低、安全可靠、可大体积高密度连续发酵培养等独特的优越之处。同时，作为真核表达系统，巴斯德毕赤酵母可对目的蛋白进行翻译后加工和修饰，即信号肽剪切、二硫键形成、蛋白的糖基化和磷酸化等过程，使外源蛋白得到正确的折叠和修饰。另外，由于该表达系统有多种受体菌和表达载体供选择，可进行胞内表达或分泌表达，有利于产物的提取和加工。迄今为止，大豆过氧化物酶的主要来源是从大豆种皮中通过物理或化学方法提取、分离、纯化。用这种方法制备SBP既费时又费力，合成成本高，生物资源浪费大，纯化困难，获得的产品价格昂贵，因此迫切需要研制一种高效廉价制备SBP的方法。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种成本低、表达量高、筛选速度快的高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法。 为解决上述问题，本发明所述的一种高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法，包括以下步骤
⑴野生型sbp基因的克隆与检测从大豆根中提取总RNA，通过RT-PCR获得的cDNA，用设计的^如基因特征引物进行PCR扩增获得野生型基因，经质量体积比为1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段；
⑵pPICZa-A-1/7重组表达载体的构建及鉴定用限制性内切酶通和及^/按双酶切法将所述野生型sbp基因连接到pPICZa-A质粒中，构建重组表达载体pPICZa-A-1p ;再用CaCl2法将所述pPICZa-A-·^/ 转化至大肠杆菌E. coli DH5a,最后筛选阳性克隆体并对该阳性克隆体进行测序；
(3)野生型sbp基因在Pichia pastor is GSl 15酵母中的表达利用InvitrogenCorporation提供的Pichia pas tor is表达系统，采用电转化法将重组质粒pPICZ a -k-sbp转化到宿主细胞PicAia pas tor is GSl 15中，培养2 3天得到GSl 15阳性克隆；将所述GSl 15阳性克隆接种至BMGY培养基中，12 18h后得到菌液A ;将100 μ I所述菌液A转接到100 ml BMMY培养基中，在甲醇诱导下分泌表达野生型基因，获得了具有生物活性的SBP ;其中所述BMMY培养基的pH值为6. O ;甲醇与BMMY培养基的体积比为O. 75% ；诱导时间为48h ；
敗sbp基因随机突变文库的构建将采用连续易错PCR法获得的突变型基因与质粒载体pPICZ a -A分别用限制性内切酶通和油a/按双酶切法进行酶切，经T4DNA酶进行催化连接反应，得到突变重组质粒pPICZ a -ksbp,该突变重组质粒pPICZ a -ksbp用CaCl2法转化至大肠杆菌DH5 α中，构建出sbp随机突变文库；
(5)高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的筛选将所述如随机突变文库用限制性内切酶SacI线性化后采用电转化法转化到宿主细胞PicAia pastor is GSl 15中，培养2 3天得到GSl 15阳性克隆；将所述GSl 15阳性克隆接种至BMGY培养基中，12 18h后得到菌液B ；将所述菌液B转入设有BMMY培养基和甲醇的48孔细胞培养板中，在甲醇诱导下进行表达；然后用96孔酶标仪测SBP活性，当该SBP活性为所述步骤⑶中由野生型4/7基因获得的SBP活性的f 2倍时，即得到高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌SBP菌株；其中所述BMMY培养基的pH值为6. O ;1 μ I菌液B接种到I ml BMMY培养基中；甲醇与IBMMY培养基的体积比为O. 75% ;诱导时间为48h。所述步骤⑴中的sbp基因特征引物是指
上游引物 Pl :5' CCGCTCGAGACTCAAGCTTCTAGGATTTGTGCC 3'；
下游引物 P2:5' GCTCTAGATTACCACTTATTCCATCGCACATACAAC 3'。本发明与现有技术相比具有以下优点1、本发明通过分子进化的方法对大豆过氧化物酶基因进行改造，改善其酶学性质，大大提高了大豆过氧化物酶的活性，可更好地适应工业应用要求。2、本发明通过基因工程的方法构建含突变大豆过氧化物酶基因的菌株，用48孔细胞培养板和酶标仪建立筛选系统，筛选速度快、灵敏、准确。 3、本发明基因工程菌是携带突变基因的PicAia pas tor is GS115酵母，pastor is GS115酵母具有分泌表达量高、稳定性好、培养成本低、安全可靠、大体积高密度连续发酵培养的优点。4、对采用本发明得到的高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌SBP菌株在BMMY培养基中大量发酵，进行三轮复筛，对分泌性的SBP粗酶液进行SDS-PAGE凝胶电泳分析(参见图5)。从图中可以看出，用本发明技术路线所制备的大豆过氧化物酶分子量与其理论值一致，大小为40kD。5、以愈创木酚为底物，分析粗酶液的酶活性；依次向比色皿中加入O. 05 mo I · Γ1磷酸缓冲液(pH=5. 5)1. 5 ml, 2% H2O2 O. 5 ml,O. 05 mo I · L—1 愈创木酚溶液 0· 5 ml，粗酶液0.5 ml。混匀后，在470 nm下测定吸光度，每隔I min读数I次，共测5 min，以每分钟内A47tl变化O. 01为I个酶活性单位⑶(参见图6)。从图中可以看出，本发明方法中PicAiapastor I s GS115表达野生型大豆过氧化物酶的酶活性为19. 7 U · πιΓ1，突变菌株的酶活性为30.1 U · ml'32. 4 U · πιΓ1，与野生酶活性相比，催化活性大大提高。
下面结合附图对本发明的具体实施方式
作进一步详细的说明。图1为本发明大豆根总RNA的琼脂糖凝胶电泳图。其中A为2& 、B为C为5夕。图2为本发明如基因经连续易错PCR的琼脂糖凝胶电泳图。其中M为DNAMarker, 1、2、3、4为经易错PCR获得的如DNA片段。图3为本发明突变pPICZ a-A-1/7重组质粒转化万.co7i DH5a，构建随机突变文库结果图。其中左图为阴性对照，右图为突变pPICZa-A-1/7重组质粒转化疋
DH5 a在LLB平板(含抗生素zeocin)上长出的阳性克隆。图4为本发明突变文库转化PicAia pastor is GS115结果图。其中左图为阴性对照，右图为突变文库经线性化电转化/7ZcAia pastor I s GS115，在YPDS平板(含抗生素zeocin)上长出的阳性克隆。图5为本发明SBP的SDS-PAGE凝胶电泳图，其中M为标准蛋白分子质量；2、3、4、5分别为筛选得到的突变菌株，分泌性表达的SBP。图6为本发明SBP的活性检测结果图。
具体实施例方式下述实验中凡未注明具体条件的实验方法，均按常规条件进行。一种高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法，包括以下步骤
⑴野生型sbp基因的克隆与检测从大豆根中提取总RNA，通过RT-PCR获得的cDNA，用设计的^如基因特征引物进行PCR扩增获得野生型基因，经质量体积比为1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段。具体如下
a根据Chen等在NCBI核酸数据库报道的4/7基因[U51191 (GmEpal)]序列，用PrimerPremier 5.0设计了一对寡核苷酸引物，引物间不形成二聚体结构，且引物内部无发卡环结构。为基因克隆和表达的需要，以及检测的方便，上游引物Pl的5/ -末端加上了酶切位点Xhol (C/TCGAG)和保护碱基，下游引物P2的5/ -末端加上了酶切位点Xbal (T/CTAGA)、保护碱基和一个终止密码子(TTA)，设计的引物序列(委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。)如下
Pl 5/ CCGCTCGAGACTCAAGCTTCTAGGATTTGTGCC 3'；
P2 5/ GCTCTAGATTACCACTTATTCCATCGCACATACAAC 3'。b从大豆根中提取总RNA，通过RT-PCR获得总mRNA的cDNA，即取提取的大豆根总RNA 12μ1、01igodT(18) 2μ 1，70°C保温IOmin后迅速在冰上急冷2min以上，再加A 5XReaction buffer 4 μ I> dNTP mix (lOmol/L) I μ1、RNase inhibitor(40U/μ I)0· 5μ1、RTase (20U/μ I) O. 5 μ I 混匀，42°C保温 60min，70°C保温 15min 后冰上冷却，得cDNA ;再以cDNA为模板，加入以下反应组分到置于冰上的PCR管中，混匀。以95°C预变性5min ;95°C变性 lmin，57°C退火 lmin，72°C延伸1. 5min，共 35 个循环；72°C延伸 7min。进行PCR反应，获得4/7基因，经质量体积比为1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段，大小为Ikb。其中PCR反应体系为
权利要求
1.一种高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法，包括以下步骤⑴野生型Sbp基因的克隆与检测从大豆根中提取总RNA，通过RT-PCR获得的cDNA，用设计的^如基因特征引物进行PCR扩增获得野生型基因，经质量体积比为1. 0%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA片段；⑵pPICZa-A-1/7重组表达载体的构建及鉴定用限制性内切酶通和及^/按双酶切法将所述野生型sbp基因连接到pPICZa-A质粒中，构建重组表达载体pPICZa-A-1p ;再用 CaCl2法将所述pPICZa-A-·^/ 转化至大肠杆菌E. coli DH5a,最后筛选阳性克隆体并对该阳性克隆体进行测序；(3)野生型sbp基因在Pichia pastor is GSl 15酵母中的表达利用Invitrogen Corporation提供的Pichia pas tor is表达系统，采用电转化法将重组质粒 pPICZ a -k-sbp转化到宿主细胞PicAia pas tor is GSl 15中，培养2 3天得到GSl 15阳性克隆；将所述GSl 15阳性克隆接种至BMGY培养基中，12 18h后得到菌液A ;将100 μ I所述菌液A转接到100 ml BMMY培养基中，在甲醇诱导下分泌表达野生型基因，获得了具有生物活性的SBP ;其中所述BMMY培养基的pH值为6. O ;甲醇与BMMY培养基的体积比为O. 75% ； 诱导时间为48h ；敗sbp基因随机突变文库的构建将采用连续易错PCR法获得的突变型基因与质粒载体pPICZ a -A分别用限制性内切酶通和油a/按双酶切法进行酶切，经T4DNA酶进行催化连接反应，得到突变重组质粒pPICZ a -ksbp,该突变重组质粒pPICZ a -ksbp用 CaCl2法转化至大肠杆菌DH5 α中，构建出sbp随机突变文库；(5)高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的筛选将所述如随机突变文库用限制性内切酶SacI线性化后采用电转化法转化到宿主细胞PicAia pastor is GSl 15中，培养2 3天得到GSl 15阳性克隆；将所述GSl 15阳性克隆接种至BMGY培养基中，12 18h后得到菌液B ； 将所述菌液B转入设有BMMY培养基和甲醇的48孔细胞培养板中，在甲醇诱导下进行表达； 然后用96孔酶标仪测SBP活性，当该SBP活性为所述步骤⑶中由野生型4/7基因获得的 SBP活性的f 2倍时，即得到高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌SBP菌株；其中所述BMMY 培养基的PH值为6. O ;1 μ I菌液B接种到I ml BMMY培养基中；甲醇与IBMMY培养基的体积比为O. 75% ;诱导时间为48h。
2.如权利要求1所述的一种高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法，其特征在于所述步骤⑴中的s如基因特征引物是指上游引物 Pl :5' CCGCTCGAGACTCAAGCTTCTAGGATTTGTGCC 3'；下游引物 P2:5' GCTCTAGATTACCACTTATTCCATCGCACATACAAC 3'。
全文摘要
本发明涉及一种高效表达大豆过氧化物酶基因工程菌的构建方法，该方法是指先从大豆根中提取总RNA，通过RT-PCR获得总mRNA的cDNA，用sbp基因特征引物，PCR扩增获得sbp基因并测定其序列；其次用连续易错PCR的方法突变sbp基因，构建出sbp基因随机突变文库；最后将此突变基因在Pichiapastoris表达系统中分泌型表达SBP，采用微孔板筛选法筛选出高效表达SBP的基因工程菌。本发明具有生产大豆过氧化物酶成本低、表达量高、筛选速度快的特点。
文档编号C12N1/19GK102994540SQ201210518050
公开日2013年3月27日 申请日期2012年12月6日 优先权日2012年12月6日
发明者王黎, 曾家豫, 廖世奇, 袁红霞, 毛爱红, 马瑾, 田彩平, 魏政丽 申请人:甘肃省医学科学研究院