一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用
【专利摘要】本发明公开了一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和应用，该方法是通过利用CRISPR/Cas9系统特异性地切割Y染色体上的Rbmy基因来实现动物性别控制的。Rbmy基因编码一种生殖细胞特异的核蛋白，这种蛋白是与精子发生相关的一种重要因子，对Rbmy基因进行切割，可以使Rbmy基因丧失活性，进而使得Y精子或带有Y精子的受精卵丧失活性而无法发育为正常的胚胎，最终来提高雌性动物的出生比例，达到性别控制的目的。由此，可以通过该方法对动物后代出生的性别比例进行控制，以达到使具有更好的经济价值的雌性动物出生比例提高，从而大大提高生产效率和经济效应。
【专利说明】
-种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法和 应用
技术领域
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，尤其设及一种基于对肺my基因进行编辑来实现动 物性别控制的方法和应用。
【背景技术】
[0002] 性别控制（Sex control)是指人为地干预动物的生殖过程，使得雌性动物生产出 符合特定性别后代的一口技术。动物性别控制技术在预防人类遗传疾病、提高畜禽生产能 力、动物遗传育种及溯危珍稀动物的保护等方面有着重要意义。
[0003] 目前大约有300余种伴性遗传疾病与出生时婴儿的性别相关(如血友病、红绿色盲 和遗传性肾炎等），在妊娠早期利用性别控制技术可W预测伴性遗传病的发生情况，从而达 到产前诊断预防疾病发生的目的。在动物生产上，为了获得更多的牛奶和禽蛋，需要更多地 繁殖出雌性动物;为了获得鹿茸、廳香W及提高动物的生长速度，获得更多的肉类产品，需 要大量的雄性动物。在动物遗传育种方面，性别控制技术可W减少育种年限，提高选育的效 率，提供更多的终端父本及终端母本，同时可W预防奶牛由于异卵双生导致的不孕症。在捶 救溯危保护动物方面，性别控制技术能够扩大保护动物的种群，提高雄性动物的利用率。
[0004] 应用动物性别控制技术产生的社会价值W及经济价值都是巨大的，但是在动物生 产中很难做到很好的性别控制效果。目前动物性别控制技术只在牛上有较为广泛的应用， 要做到多种动物的大规模推广，还需要探索更为有效合理、更加成熟的方法。
[0005] CRISPR/Cas9基因组编辑技术，是指规律成簇间隔短回文重复序列（Clustered regularly interspaced sho;rt pal in 化 omic r 邱 eats, CRISPR)是一种被发现存在于细菌 及古生菌中，能够特异性地识别并降解入侵病毒或隧菌体携带的外源DNA的适应性免疫系 统，其中II型CRISPR/Cas9系统是近年来应用于基因组编辑最热口的技术之一。目前 CRISPR/化s9系统已被广泛地应用于改造动物的细胞基因组，制作模式动物、植物，抵抗微 生物W及人类医学上的疾病治疗、消除免疫排斥等各方面。CRISPR/tas9的作用机理是由一 个带特异性结合位点的单一导向RNA(single guide RNA，s排NA)引导Cas9核酸酶到革己位 点，在祀位点附近发生特异性地切割，最终DNA双链发生断裂或被修复或导致细胞死亡。
[0006] CRISPR/tas9基因组编辑技术特异性地切割基因组的能力使得该技术应用于动物 性别控制成为可能，根据CRISPR/化s9系统的作用特点，只要针对动物的X或Y染色体保守序 列设计多个切割位点，使X或Y染色体失活，使得雄性动物只产生一种类型的精子或使携带 某种类型性染色体的受精卵无法正产发育，而达到动物性别控制的目的。但是关于CRISPR/ 化s9系统对性染色体的基因编辑研究尚未见报道。
[0007] 通过对小鼠性染色的深度测序，发现在小鼠的Y染色体上，有的基因拥有许多重复 序列。运些多拷贝基因大多数来自于Y染色体的后天获得，主要有517、53*7、5^7，它们的拷 贝数都在100个W上，且对应的等位基因拷贝数均在10个W上。运些基因多数只在雄性小鼠 的生殖系里表达，与精子发生密切相关，敲除部分Y染色体长臂会导致运部分基因拷贝数减 少，会造成精子的崎形甚至雄性不育，同时会增加雌性后代的出生比例。来自于祖先遗传的 Y染色体多拷贝基因只有Rbmy-个基因，据估计它的拷贝数有30个，且它的等位基因 Rbmx位 于X染色体上，只有一个拷贝数。Rbmy基因只有6个基因座会发生转录，其中的两个基因座会 翻译蛋白。Rbmy编码一种生殖细胞特异的核蛋白，运种蛋白是与精子发生相关的一种重要 因子，另外Rbmy基因还与精子的能动性有关。
【发明内容】
[000引本发明的目的是提供一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法 和应用，W解决上述问题。
[0009] 根据本发明的一个方面，提供了一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控 审IJ的方法和应用，该方法是通过利用CRISPR/tas9系统特异性地切害化染色体上的Rbmy基因 来实现动物性别控制的。Rbmy基因编码一种生殖细胞特异的核蛋白，运种蛋白是与精子发 生相关的一种重要因子，对Rbmy基因进行切割，可W使Rbmy基因丧失活性，进而使得Y精子 或带有Y精子的受精卵丧失活性而无法发育为正常的胚胎，最终来提高雌性动物的出生比 例，达到性别控制的目的。通过CRISPR/化s9系统可W特异性的剪切Rbmy基因，避免对其他 基因生产误剪，可W准确的使Y染色体丧失活性，进而影响雄性动物的出生，而对雌性动物 不产生影响。由此，可W通过该方法对动物后代出生的性别比例进行控制，W达到使具有更 好的经济价值的雌性动物出生比例提高，从而大大提高生产效率和经济效应。
[0010] 在一些实施方式中，CRISPR/Cas9系统特异性地切割Rbmy基因的祀位点基因序列 如SEQ ID NO:6所示。CRISPR/Cas9系统的切割效率与目的基因的祀位点基因序列息息相 关，祀位点不合适时容易造成脱祀，影响切割效率。同时，CRISPR/Cas9系统的特异识别也与 革己位点的基因序列相关联。由此，在Rbmy基因的祀位点基因序列如SEQ ID N0:6所示时，可 W达到最高的特异切割的效率，达到最好的性别控制效果。
[0011] 该基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法包括如下步骤：
[0012] 1)选择肺my祀基因上的祀位点；
[0013 ] 2)根据祀位点基因序列设计相应的SgRNA表达载体及祀载体；
[0014] 3)将祀载体、SgRNA表达载体与地Cas9质粒共同转染细胞，进行体外检则S排NA表 达载体的切割效率；
[0015] 4)体外检测筛选出有效的SgRNA表达载体；
[0016] 5)将筛选出的有效SgRNA表达载体与地化s9质粒混合显微注射入动物受精卵的雄 原核中；
[0017] 6)对处理后的受精卵进行胚胎移植至代孕雌性动物子宫内。
[0018] 由此，可W有效的达到控制动物后代性别的出生比例，来提高生产效率及经济效 益。
[0019] 在一些实施方式中，筛选出的有效SgRNA表达载体为pU6-sgRNA6表达载体，该pU6-sgRNA6表达载体包含如SEQIDN0:17和沈QIDN0:18所示的序列。CRISPRA：as9系统通过 SgRNA与祀位点特异性识别，然后通过化s9核酸酶在祀位点处发生特异切割，最终实现特异 切割相应基因，实现基因编辑的目的，最终使该祀基因失活。因此，SgRNA序列与祀位点的结 合效率直接影响了最终的切割效率，包含如SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示序列的pU6- sgRNA6表达载体注射入小鼠受精卵雄原核后，可W达到最大效率的切割Rbmy基因，来提高 雌性小鼠的出生率。
[0020] 在一些实施方式中，pU6-sgRNA6表达载体显微注射入动物受精卵雄原核的浓度为 IO-SOngAil，地Cas9质粒显微注射入动物受精卵雄原核的浓度为25-125ng/山，pU6-sgRNA6 表达载体与Ph化s9质粒混合物的体积为5-15pl。在显微注射时，质粒的浓度直接影响了切 割的效率，当浓度太高时会给受精卵造成过重的代谢负担，进而影响受精卵的成活率;而当 质粒浓度太低时，会影响祀基因的切割效率，最终影响性别控制的效果。
[0021] 根据本发明的另一个方面，提供了一种哺乳动物性别控制方法的应用，该方法能 够应用于后代动物性别的控制，尤其是在生产上大规模应用该方法来提高生产效率。同时， 该方法还能用于疾病的预防与治疗，尤其是伴性遗传疾病的预防与治疗。
【附图说明】
[0022] 图1为pU6-sgRNA空载体的双酶切电泳结果图，图中M为化15000DNA maker;l为 pU6-sgRNA空载体质粒，2为抓Si单酶切产物。
[0023] 图2为pU6-sgRNA空载体、pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6表达载体测序结果。
[0024] 图3为pT7-s排NA空载体双酶切电泳结果图，图中M为DL15000DNA maker，1为pT7-SgRNA空载体质粒，2为抓Si单酶切产物。
[0025] 图4为pT7-sgRNA空载体、pT7-sgRNAl至pT7-sgRNA6表达载体测序结果。
[00%]图5为pT7-Cas9载体线性化电泳结果，Ml为DL15 OOODNA maker,M2为DLlO OOODNA maker，1为超螺旋的pT7-Cas9质粒，2为线性化的pT7-Cas9质粒。
[0027] 图6为SgRNA的体外转录模板电泳结果，图中M为化500DNA maker, 1-6分别为 SgRNAl至SgRNAe体外转录模板，7为空载体扩增对照。
[0028] 图7为化s9mRNA的体外转录电泳结果，图中M为化5000DNA Markera和2为加尾前 的Cas9mRNA，3和4为加尾后的Cas9mRNA。
[0029] 图8为SgRNA的体外转录电泳结果，图中M为化500DNA Marker, 1-6分别代表体外转 录出的SgRNAl 至 SgRNAe。
[0030] 图9为不同祀载体的测序结果图。
[0031] 图10为pGCS祀载体与pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6、地Cas9共转染293细胞OFP巧光效 果图（100 X )，图中A为各祀载体与地化s9共转染组，B为各祀载体与对应pU6-sgRNA载体及 地Cas9共转染组，1-6为pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6的载体。
[0032] 图11为祀GFFP祀载体与pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6、地Cas9共转染293细胞巧光效 果图。
[0033] 图12为流式细胞术检测293细胞巧光比例结果图，图中B为空白对照组，NC为阴性 对照组，1-6为祀GFFP载体、phCas9与pU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6共转染组，P为祀GFP-Nl阴性 转染对照组。
[0034] 图13为不同处理组细胞巧光效率的比较结果图，图中B为空白对照组，NC为阴性对 照组，1-6为祀GFFP载体、phCas9与pU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6共转染组，P为祀GFP-Nl阴性转 染对照组。**表示与NC相比差异极显著(P<0.0 l)。
[0035] 图14为不同处理组平均巧光强度值的比较结果图，图中B为空白对照组，NC为阴性 对照组，1-6为祀GFFP载体、phCas9与pU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6共转染组，P为祀GFP-Nl阴性 转染对照组。**表示与NC相比差异极显著(P<0.0 l)。
[0036] 图15为不同SgRNA对祀载体pEGFFP的切割效果电泳结果图，图中M为 DNAlOOOOMarker，P为祀载体pEGFFP，1-6为SgRNAl至S排NA6与Cas9酶切结果，L为线性化 祀GFFP载体。
[0037] 图16为不同SgRNA对各祀片段切割效果电泳结果图，图中M为DNA 5(K)bp Marker,A 为祀片段+Cas9蛋白，B为祀片段+sgRNA(l-6)+Cas9蛋白，1-6为SgRNAl至sgRNA6。
【具体实施方式】
[0038] 下面结合附图对本发明作进一步详细的说明。
[0039] pU6-sgRNA空载体、pT7-sgRNA空载体、pT7-Cas9空载体、phCas9载体和pGCS空载体 来源于中国科学院广州医药与健康中屯、;pEGFP空载体基因序列来源于GenBank accession number:U55762.1，该载体购买于宝生物工程(大连)有限公司。
[0040] 1、应用CRISPR/tas9系统切割小鼠 Y染色体祀位点的选择
[0041 ]根据在线软件化 ttps: //chopchop. rc. fas. harvard. edu/lndex. php)的预测结合 SgRNA的识别特点W及最少的脱祀概率，本实验挑选了 Y染色体多拷贝基因 Rbmy的6个祀位 点进行切割检测，祀位点的具体信息见下表1。
[0042]
[0043] 检测CRI SPR/Cas9系统在各个祀位点处的切割效率，需要对祀位点附近DNA进行 PCR扩增，目的片段在500bp左右且祀位点不能位于片段中央。设计突变检测效率引物如下 表：
[0044]
[0045] 2、SgRNA表达载体的构建
[0046] 2. lpU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6表达载体的构建
[0047] SgRNA真核表达载体骨架质粒pU6-sgRNA含有2个化Si酶切位点，用化Si内切酶进 行单酶切，产生两个粘性末端。结果表明pU6-sgRNA空载体可W经化Si内切酶酶切完全，可 用于后续与各退火DNA双链进行连接，结果见附图1。
[004引表3为设计合成的各祀位点退火DNA双链序列，两端分别带有不同的粘性末端。
[0049]
[0050] 将线性化后的pU6-sgRNA空载体与各祀位点合成的退火DNA双链化6-sgRNAl至U6-sgRNA6)进行连接、转化、涂板，挑取阳性单克隆进行测序，验证载体构建的准确性。由测序 结果可知，针对各祀位点的pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6真核表达载体序列符合设计序列，可 W用于后续实验，结果见附图2。
[0化1 ] 2.2pT7-sgRNAl至pT7-sgRNA6载体的酶切与验证
[0052] SgRNA原核表达载体骨架质粒pT7-sgRNA含有2个化Si酶切位点，用化Si内切酶进 行单酶切，产生两个粘性末端。结果表明pT7-sgRNA空载体可W经化Si内切酶酶切完全，可 用于后续与各退火DNA双链进行连接，结果见附图3。
[0053] 表4为设计合成的各祀位点退火DNA双链序列，两端分别带有不同的粘性末端。
[0化4]
[0055] 将线性化后的pT7-sgRNA空载体与各祀位点合成的退火DNA双链(T7-sgRNAl至T7- sgRNA6)进行连接、转化、涂板，挑取阳性单克隆进行测序，验证载体构建的准确性。由测序 结果可知，针对各祀位点的pT7-sgRNAl至pT7-sgRNA6原核表达载体序列符合设计序列，可 W用于后续实验，结果见附图4。
[0化6] 3、化s9mRNA及SgRNA的体外转录
[0057] (1)体外转录模板的制备
[0化引用MssI内切酶线性化由T7启动子启动表达化s9的载体pT7-化s9,线性化pT7-化s9 载体电泳结果见附图5,切胶回收后用于Cas9mRNA体外转录模板，SgRNA体外转录模板由 pT7-sgRNA经PCR扩增得到，结果见附图6。
[0059] (2)体外转录
[0060] 根据肥B公司的T7Quick High Yield RNA Syntheis Kit体外转录试剂盒方法对 Cas9mRNA及SgRNA进行体外转录。SgRNAl至sgRNA6体外转录模板由pT7-sgRNAl至pT7-sgRNA6经PCR扩增得到，SgRNAl至sgRNA6序列表见表5,由于Cas9mRNA要经过体外加尾的过 程才能在细胞内翻译蛋白，故对化s9体外转录要有加 polyA尾的过程，而SgRNA不需要翻译 蛋白，不必进行加尾操作。转录产物经电泳分析条带完整，经测定其浓度均在1000 ngAiLW 上，分装后于-80°C保存备用，电泳检测结果见附图7和附图8<Xas9mRNA可用于真核细胞的 转染及受精卵的显微注射，SgRNA转录序列既可配合化s9mRNA在真核细胞及胚胎内发挥作 用，又可W在与Cas9蛋白结合形成特异的人工核酸内切酶。
[0061]
[0062] 4、祀载体与pU6-sgRNAl至pU6-sgRNA6、地Cas9载体共转染293细胞筛选最有效的 pU6-sgRNA表达载体
[0063] (1)祀载体的构建
[0064] 根据选定的祀位点，设计合成相应的DNA退火双链，两端加上粘性末端，序列信息 如下表6。
[00 化]
[0066]
[0067]将DNA退火双链与pGCS空载体连接，转化后挑取阳性单克隆进行测序，结果表明各 祀位序列均构建到空载体中形成相应的pGCS祀载体，序列信息与设计相符，可用于后续试 验，结果见附图9。
[006引 （2)pGCS祀载体与pU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6、地Cas9共转染293细胞
[0069] pGCS载体带有不完整的澄色巧光蛋白（Orange Fluorescent Protein，0FP)序列， 祀序列位于OFP序列中间，正常情况下pGCS转染细胞不会有巧光信号。当祀序列位置发生切 割突变时由于同源重组的作用PGCS中的OFP序列修复完整，转染后的细胞可W检测到巧光 信号。结果表明当祀载体与地化s9共转染29始田胞时，检测不到OFP的巧光信号，当加入pU6-sgRNA(l-6)时CRISPR/Cas9系统在祀序列处发生切割，能够检测到微弱的OFP巧光信号，结 果见附图10。
[0070] (3)pEGFP祀载体与pU6-s曲NAl至pU6-s曲NA6、地Cas9共转染293细胞
[0071] 设计合成祀载体祀GFP，使不同的祀序列连接在位于EGFP基因序列的中间。正常情 况下祀GFP转染细胞会有微弱的巧光信号。当祀序列位置发生切割突变时由于同源重组的 作用EGFP序列修复完整，转染后的细胞可W检测到较强的巧光信号。
[0072] 结果表明，当祀载体祀GFP与地化s9共转染293细胞时，检测到微弱的巧光信号，当 加入pU6-sgRNA( 1-6)时CRISPR/化s9系统在祀序列处发生切割，能够检测到较强的EGFP巧 光信号。对转染4她后的各组细胞进行收集，用流式细胞仪检测各组细胞的巧光效率和平均 巧光强度值，结果见附图11-附图14。结果表明相对于仅有祀GFP和地化s9转染的阴性对照 组，加入pU6-sgRNA(l-6)后各组细胞的巧光效率均高于对照组且平均巧光强度也高于对照 组。且加入pU6-sgRNA6时巧光效率接近阳性对照祀GFP-Nl转染组，平均巧光强度高于阳性 对照组。说明6个pU6-sgRNA表达载体均能够发生切割作用，且pU6-sgRNA6质粒效果最好。
[0073] 5、不同SgRNA与化s9蛋白质粒体外切割祀位点的效率
[0074] 将体外转录的SgRNAl至SgRNAe与化s9蛋白质粒混匀，37°C解育lOmin，使其形成一 种类似于限制性内切酶的蛋白复合物，向复合物中加入50ng的含有SgRNA识别位点的DNA， 37°C反应化后进行琼脂糖凝胶电泳，即可验证SgRNA在各自祀位点的切割效率。
[0075] (1)不同SgRNA对祀载体祀GFFP的切割效果
[0076] W祀载体祀GFFP为酶切反应底物，分别加入相同含量的sgRNA(5化g)，37°C反应化 后进行琼脂糖凝胶电泳。检测结果表明，除了sgRNA2没有明显切割效果，其余SgRNAU sgRNA3、sgRNA4、SgRNAS及SgRNAe均有较好的切割效果，结果见附图15。
[0077] (2)不同SgRNA对各祀片段切割效果
[007引 W雄鼠基因组DNA为模板，按照表2中列举的引物序列扩增含有不同祀位点在内的 DNA祀片段，纯化回收各祀片段后分别用不同SgRNA与化s9蛋白质粒复合物进行切割，37°C 反应Ih后进行琼脂糖凝胶电泳。结果表明，SgRNAl至sgRNA6中，仅有sgRNA6对其祀片段有较 高的切割效率，灰度扫描结果显示其切割效率能够达到100%，且切割后的片段大小符合预 期。运说明不同SgRNA对各祀序列切割效果并不一致，其中S排NA6有最佳切割效率，结果见 附图16。
[0079] 6、注射pU6-sgRNA6与地化s9质粒对出生小鼠性别比例的影响
[0080] 收集受精卵并将20ngAU的pU6-sgRNA6与50ng/山曲化s9质粒混合物显微注射入 受精卵的雄原核中，注射体积为IOpl,实验组共注射807个受精卵，对照组共注射801个受精 卵，注射完毕实验组共有746枚存活，存活率92.4%，对照组共有739枚存活，存活率92.3 %。 注射后的胚胎移植到假孕受体母鼠的输卵管，采用双侧输卵管移植手术，每侧移植15个左 右的胚胎，实验组共移植27只受体母鼠，其中有22只成功妊娠并产下后代，共产下小鼠137 只，其中雌性小鼠83只，雄性小鼠54只。经X2检验与理论性别比例(33/33)相比差异显著(P< 0.05)。对照组共移植26只受体母鼠，其中有23只成功妊娠并产下后代，共产下小鼠191只， 其中雌性小鼠98只，雄性小鼠93只。经X2检验与理论性别比例（33/33)相比差异不显著(P〉 0.05)，结果如下表6:
[0081]
[0082]结果表明，当采用pU6-sgRNA6与phCas9质粒混合物显微注射小鼠受精卵雄原核 后，将受精卵移植入代孕母鼠子宫内，可W显著降低出生小鼠的雄性比例。表明由pU6-SgRNAe与地化s9质粒混合物组成的CRISPR/tas9系统可W特异性的切割Y精子内Y染色体上 的Rbmy基因，最终使雄性受精卵无法发育成正常的雄性胚胎，最终来达到性别控制的目的。
[0083] 在其他实施例中，pU6-sgRNA6质粒(表达载体)显微注射的浓度还可W为lOng/山、 1 SngAU、30ngAU 或 SOngAU 等其他浓度。
[0084] 在其他实施例中，曲Cas9质粒显微注射的浓度还可W为25ngAU、40ng/山、75ng/ii 1或125ngAil等其他浓度。
[00化]在其他实施例中，pU6-sgRNA6质粒(表达载体)与曲化s9质粒混合物显微注射的体 积还可W为5pl、8pl或15pl等其他体积。
[0086] 在其他实施例中，动物不仅限于小鼠，还包括猪、牛、羊等其他的动物。
[0087] 在其他实施例中，染色体编辑不仅限于CRISPR/Cas9系统特异性地切割，还包括 RNA干扰、同源重组、基因敲出及插入等其他能对基因进行编辑的技术。
[0088] 在其他实施例中，Y染色体上的基因编辑的祀基因不仅限于肺my基因，还可W为其 他任何基因。
[0089] W上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不 脱离本发明创造构思的前提下，还可W做出若干变形和改进，运些都属于发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法，其特征在于，所述方法 是通过利用CRISPR/Cas9系统特异性地切割Y染色体上的Rbmy基因来实现动物性别控制的。2. 根据权利要求1所述的基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法，其特 征在于，所述的CRISPR/Cas9系统特异性地切割Rbmy基因的靶位点基因序列如SEQ ID N0:6 所示。3. 根据权利要求1或2所述的基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法，其 特征在于，所述方法包括如下步骤： 1) 选择Rbmy革E1基因上的革E1位点； 2) 根据靶位点基因序列设计相应的sgRNA表达载体及靶载体； 3) 将祀载体、sgRNA表达载体与phCas9质粒共同转染细胞，进行体外检测sgRNA表达载 体的切割效率； 4) 体外检测筛选出有效的sgRNA表达载体； 5) 将筛选出的有效sgRNA表达载体与phCas9质粒混合显微注射入动物受精卵的雄原核 中； 6) 对处理后的受精卵进行胚胎移植至代孕雌性动物子宫内。4. 根据权利要求3所述的基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法，其特 征在于，所述的有效sgRNA表达载体为pU6-sgRNA6表达载体，所述的pU6-sgRNA6表达载体包 含如SEQ ID NO: 17和SEQ ID NO: 18所示的序列。5. 根据权利要求4所述的基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法，其特 征在于，所述的pU6-sgRNA6表达载体显微注射入动物受精卵雄原核的浓度为10-50ngAU。6. 根据权利要求3所述的基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法，其特 征在于，所述的phCas9质粒显微注射入动物受精卵雄原核的浓度为25-125ng/yl。7. 根据权利要求4所述的基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制的方法，其特 征在于，所述注射入动物受精卵雄原核的pU6-sgRNA6表达载体与phCas9质粒混合物的体积 为5-15pl〇8. -种基于对Rbmy基因进行编辑来实现动物性别控制方法的应用，其特征在于，所述 的方法能够应用于后代动物性别的控制，尤其是在生产上大规模应用所述方法来提高特定 性别动物的出生率，进而提高生产效率。
【文档编号】C12N15/877GK105861554SQ201610307611
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年5月10日
【发明人】吴珍芳, 李紫聪, 杨晓峰, 李崇, 刘德武, 蔡更元
【申请人】华南农业大学