红色罗丹明染料示踪基因纳米载体的制备方法及应用
【专利摘要】本发明涉及一种红色罗丹明染料示踪基因纳米载体的制备方法及应用。本发明的技术方案包括：介孔硅壳纳米颗粒表面连接分子量大小为1,800的低分子量聚醚酰亚胺(PEI)。红色罗丹明染料染料的包埋:将红色罗丹明染料包埋至介孔二氧化硅纳米的介孔中。制备出的红色罗丹明染料示踪基因纳米载体的直径为80～150纳米，孔径为0.5～2纳米，载药率为20～40％。其基因转染效率为40～70％，细胞存活率为80％～95％。此外，还可通过观察纳米载体内红色罗丹明染料的分布情况来实时跟踪基因所到达的位置。
【专利说明】
红色罗丹明染料示踪基因纳米载体的制备方法及应用
技术领域
[0001]本发明涉及一种红色罗丹明染料示踪基因纳米载体的制备方法及应用，属生物技术和医药技术领域。
【背景技术】
[0002]基因转染是一种非常常规的生物和医药技术，但是通常的基因转染用的试剂是相对分子质量为25，000的聚醚酰亚胺(PEI)，虽然该PEI比相对分子质量为I，800的PEI的转染效率高，但是其细胞毒性也比相对分子质量为I，800的PEI大得多，因此将相对分子质量为I，800的PEI连接至一纳米微球上便可以成功制备出一种转染效率高，细胞毒性低的新型基因转染载体。
[0003]此外，用常规的基因转染试剂进行转染细胞时，很难方便的示踪基因载体的具体位置，也就无法判定目标细胞是否有外源基因的的进入。于是可以通过先合成一种含有介孔的纳米基因载体，然后装载有机染料(如可以对细胞质进行着色的红色罗丹明染料)来对细胞核进行着色，以达到示踪基因载体和对靶向细胞着色的目的，并评估目的基因是否进入了靶向细胞。因此，研制出一种具有转染效率高，细胞毒性小，并且可以实时跟踪外源基因的纳米载体等优势的新型基因载体具有重大的意义，在生物技术和医药技术领域具有重要的科研和临床应用前景。
【发明内容】
[0004]根据现有技术的不足，我们提出具有转染效率高，细胞毒性小，并且可以实时跟踪外源基因的纳米载体等优势的新型基因载体的制备方法。
[0005]本发明的技术方案包括:介孔硅壳纳米颗粒表面连接分子量大小为I，800的低分子量聚醚酰亚胺(PEI)。红色罗丹明染料染料的包埋:将红色罗丹明染料包埋至介孔二氧化娃纳米的介孔中。
[0006]本发明的优势:I)具有较高的基因转染效率。2)具有较低的细胞毒性。3)可以通过观察纳米载体内红色罗丹明染料的分布情况来实时跟踪基因所到达的位置。
[0007]具体技术方案如下:
[0008]—种红色罗丹明染料示踪基因纳米载体的制备方法;其特征是步骤如下:
[0009]I)称取介孔二氧化硅纳米颗粒用去离子水配制成I?100毫克每毫升的溶液，加入质量比为1:3?1:30的3-溴丙酸，在磁力搅拌条件下，搅拌反应6?12小时，得到羧基化的介孔二氧化娃纳米颗粒；
[0010]2)将羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒溶解于去离子水中；加入质量比为1:1?1:
10、相对分子质量为I，800的聚醚酰亚胺，并在磁力搅拌条件下，搅拌反应6?12小时;待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀I?3遍，得到可吸附DNA的基因纳米载体；
[0011]3)将基因纳米载体配成I?10毫克每毫升的无水乙醇溶液，然后加入与基因纳米载体的质量比为1:2?1:20的红色罗丹明染料，在磁力搅拌条件下，搅拌反应6?12小时;待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀I?3遍，得到实时跟踪外源基因的介孔二氧化硅基因纳米载体。
[0012]制备的红色罗丹明料示踪基因纳米载体，直径为80?150纳米，孔径为0.5?2纳米，载药率为20?40 %。
[0013]本发明的方法制备的红色罗丹明染料示踪基因纳米载体，其基因转染效率为40?70 %，细胞存活率为80 %?95 %。
[0014]本发明可通过观察纳米载体内红色罗丹明染料的分布情况来实时跟踪基因所到达的位置。
[0015]具体说明如下:
[0016]介孔二氧化娃基因纳米载体的步骤如下:
[0017]I)介孔二氧化硅纳米颗粒的羧基化:取一干净的小玻璃瓶，向其中量取浓度为5?10毫克/毫升，直径为80?150纳米，孔径为0.5?2纳米的介孔二氧化硅纳米颗粒。然后加入10?100毫克的3-溴丙酸，以50?100W的功率超声溶解3-溴丙酸，最后于100?500转/分钟，15?50°C条件下搅拌反应6?12小时。待反应结束后，以9,000?11，000转/分钟，离心5?20分钟，并用去离子水洗涤沉淀I?3遍。
[0018]2)介孔硅壳纳米颗粒表面连接聚醚酰亚胺(PEI):将步骤I)中羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒溶解至2?5毫升的去离子水中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入30?200微升，相对分子质量为I，800的聚醚酰亚胺(PEI)，并于100?500转/分钟，，15?50°C条件下搅拌反应6?12小时。待反应结束后，以9，000?11，000转/分钟，离心5?20分钟，并用去离子水洗涤沉淀I?3遍，即得到可以吸附DNA的基因纳米载体。
[0019]3)将红色罗丹明染料包埋至介孔二氧化硅基因纳米载体中并进行基因的细胞转染:红色罗丹明染料包埋介孔二氧化硅基因纳米载体:将权利要求1所述的基因纳米载体溶解至2?5毫升的无水乙醇中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入10?50毫克的红色罗丹明染料，于100?500转/分钟，15?50°C条件下搅拌反应6?12小时。待反应结束后，以9，000?11，000转/分钟，离心5?20分钟，并用去离子水洗涤沉淀I?3遍，即得到可以实时跟踪外源基因的介孔二氧化硅基因纳米载体。
[0020]评估本发明制备的可实时示踪外源基因的介孔二氧化硅基因纳米载体的转染效果的方法如下:I)介孔二氧化硅基因纳米载体吸附质粒DNA:将得到的可实时跟踪外源基因的介孔二氧化硅基因纳米载体溶解至100?500微升的无菌去离子水中。取一无菌的1.5毫升的离心管，加入50?200微升无血清培养基OPT1-MEM和0.3?3微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀，再加入I?5微升装载有红色罗丹明染料的介孔二氧化硅基因纳米载体，并混匀后静止10?30分钟。
[0021]2)将介孔二氧化硅基因纳米载体转染基因至动物细胞:将得到的含有外源基因质粒DAN和介孔二氧化硅基因纳米载体的复合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)细胞中，再于37 °C,5% 二氧化碳培养箱中培养4?8小时后吸取培养液，加入200?500毫升的新鲜完全培养液。培养12?48小时后于荧光显微镜观察并计算转染效率。
[0022]本发明制备出的红色罗丹明染料示踪基因纳米载体的直径为80?150纳米，孔径为0.5?2纳米，载药率为20?40%。其基因转染效率为40?70%，细胞存活率为80%?95%。此外，还可通过观察纳米载体内红色罗丹明染料的分布情况来实时跟踪基因所到达的位置。
【附图说明】
[0023]图1:制备的介孔二氧化硅基因纳米载体的透射电子显微镜照片(形貌分析)。
[0024]图2:将装载有红色罗丹明染料细胞核染料的介孔二氧化硅基因纳米载体转染绿色荧光蛋白(GFP)基因至人宫颈癌细胞(Hela细胞)后的转染结果。
【具体实施方式】
[0025]下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
[0026]实施例1:
[0027]介孔二氧化硅基因纳米载体装载红色罗丹明染料并转染GFP质粒至Hela细胞:
[0028]I)红色罗丹明染料包埋介孔二氧化硅基因纳米载体:将按步骤I所述的基因纳米载体溶解至2毫升的无水乙醇中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入10毫克的红色罗丹明染料，于100转/分钟，50 °C条件下搅拌反应6小时。待反应结束后，以11，000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀I遍，即得到可以实时跟踪外源基因的介孔二氧化硅基因纳米载体。
[0029]2)介孔二氧化硅基因纳米载体吸附质粒DNA:将上述步骤I)中得到的可实时跟踪外源基因的介孔二氧化硅基因纳米载体溶解至100微升的去离子水中。取一无菌的1.5毫升的离心管，加入50微升无血清培养基OPT1-MEM和0.3微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀，再加入I微升装载有红色罗丹明染料的介孔二氧化硅基因纳米载体，并混匀后静止10分钟。
[0030]3)将介孔二氧化硅基因纳米载体转染基因至动物细胞:将上述步骤2)中得到的含有外源基因质粒DAN和介孔二氧化硅基因纳米载体的复合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)细胞中，然后于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养8小时后吸取培养液，加入200毫升的新鲜完全培养液。培养48小时后于焚光显微镜观察。
[0031]实施例2:
[0032]介孔二氧化硅基因纳米载体装载红色罗丹明染料并转染GFP质粒至Hela细胞:
[0033]I)红色罗丹明染料包埋介孔二氧化硅基因纳米载体:将按步骤I所述的基因纳米载体溶解至3毫升的无水乙醇中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入30毫克的红色罗丹明染料，于300转/分钟，35°C条件下搅拌反应9小时。待反应结束后，立即以10，000转/分钟，离心15分钟，并用去离子水洗涤沉淀2遍，即得到可以实时跟踪外源基因的介孔二氧化娃基因纳米载体。
[0034]2)介孔二氧化硅基因纳米载体吸附质粒DNA:将上述步骤I)中得到的可实时跟踪外源基因的介孔二氧化硅基因纳米载体溶解至300微升的去离子水中。取一无菌的1.5毫升的离心管，加入100微升无血清培养基OPT1-MEM和I微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀，再加入2微升装载有红色罗丹明染料的介孔二氧化硅基因纳米载体，并混匀后静止15分钟。
[0035]3)将介孔二氧化硅基因纳米载体转染基因至动物细胞:将上述步骤2)中得到的含有外源基因质粒DAN和介孔二氧化硅基因纳米载体的复合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)细胞中，然后于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养6小时后吸取培养液，加入300毫升的新鲜完全培养液。培养24小时后于焚光显微镜观察。
[0036]实施例3:
[0037]介孔二氧化硅基因纳米载体装载红色罗丹明染料并转染GFP质粒至Hela细胞:
[0038]I)红色罗丹明染料包埋介孔二氧化硅基因纳米载体:将按步骤I所述的基因纳米载体溶解至5毫升的无水乙醇中并转移至一 10毫升的玻璃瓶中，然后加入50毫克的红色罗丹明染料，于500转/分钟，50°C条件下搅拌反应12小时。待反应结束后，立即以11，000转/分钟，离心20分钟，并用去离子水洗涤沉淀3遍，即得到可以实时跟踪外源基因的介孔二氧化娃基因纳米载体。
[0039]2)介孔二氧化硅基因纳米载体吸附质粒DNA:将上述步骤I)中得到的可实时跟踪外源基因的介孔二氧化硅基因纳米载体溶解至500微升的去离子水中。取一无菌的1.5毫升的离心管，加入200微升无血清培养基OPT1-MEM和3微克的绿色荧光蛋白(GFP)质粒DNA并充分混匀，再加入5微升装载有红色罗丹明染料的介孔二氧化硅基因纳米载体，并混匀后静止30分钟。
[0040]3)将介孔二氧化硅基因纳米载体转染基因至动物细胞:将上述步骤2)中得到的含有外源基因质粒DAN和介孔二氧化硅基因纳米载体的复合物全部加入至一 24孔板或48孔板的海拉(Hela)细胞中，然后于37°C，5%二氧化碳培养箱中培养4小时后吸取培养液，加入500毫升的新鲜完全培养液。培养12小时后于荧光显微镜观察并计算转染效率，如图2所示。[0041 ] 实施例4:
[0042]形态观察、粒径及其分布测定。取介孔二氧化硅纳米基因载体溶液经离心分离后，取出沉淀物，加蒸馏水少量使分散，滴于碳支持膜上制样，在透射电镜下观察其形貌状态并拍照。透射电镜下观察到介孔二氧化硅纳米基因载体呈均匀规则的球形粒子，其直径在80?150nm范围内可控。所制得的纳米载体如图1所示。
[0043]本发明公开和提出的红色罗丹明染料示踪基因纳米载体的制备方法及应用，本领域技术人员可通过借鉴本文内容，适当改变条件路线等环节实现，尽管本发明的方法和制备技术已通过较佳实施例子进行了描述，相关技术人员明显能在不脱离本
【发明内容】
、精神和范围内对本文所述的方法和技术路线进行改动或重新组合，来实现最终的制备技术。特别需要指出的是，所有相类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，他们都被视为包括在本发明精神、范围和内容中。
【主权项】
1.一种红色罗丹明染料示踪基因纳米载体的制备方法;其特征步骤如下: 1)介孔二氧化硅纳米颗粒的羧基化:称取介孔二氧化硅纳米颗粒用去离子水配制成I?100毫克每毫升的溶液，加入质量比为1:3?1:30的3-溴丙酸，在磁力搅拌条件下，搅拌反应6?12小时，得到羧基化的介孔二氧化娃纳米颗粒； 2)介孔硅壳纳米颗粒表面连接聚醚酰亚胺:将羧基化的介孔二氧化硅纳米颗粒溶解于去离子水中；加入质量比为1:1?1:10，相对分子质量为1,800的聚醚酰亚胺，并在磁力搅拌条件下，搅拌反应6?12小时;待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀I?3遍，得到可吸附DNA的基因纳米载体； 3)将红色罗丹明染料染料包埋至介孔二氧化硅基因纳米载体中并进行基因的细胞转染:将基因纳米载体配成I?10毫克每毫升的乙醇溶液，然后加入与基因纳米载体的质量比为1:2?1:20的红色罗丹明染料，在磁力搅拌条件下，搅拌反应6?12小时;待反应结束后，用去离子水洗涤沉淀I?3遍，得到实时跟踪外源基因的介孔二氧化硅基因纳米载体。2.如权利要求1所述的方法制备的红色罗丹明染料示踪基因纳米载体，其特征是:直径为80?150纳米，孔径为0.5?2纳米，载药率为20?40%。3.如权利要求1所述的方法制备的红色罗丹明染料示踪基因纳米载体，其基因转染效率为40?70 %，细胞存活率为80 %?95 %。4.利用纳米载体内红色罗丹明染料的分布情况来实时跟踪基因所到达的位置。
【文档编号】C12N15/87GK105861561SQ201610210251
【公开日】2016年8月17日
【申请日】2016年4月5日
【发明人】常津, 郑斌, 王汉杰, 谌红彬, 潘慧卓
【申请人】天津大学