34] 图1是本发明EPHA1基因原位杂交实施流程图； 图2是本发明实施例老年性痴呆病人EPHA1过量表达图片； 图3是本发明实施例中正常人EPHA1表达图片； 图4是本发明实施例中高危人群EPHA1表达图片。
【具体实施方式】
[0035]下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应该理解，下面的实施例用于说明 而非限定本
【发明内容】
，任何形式上的改变或变通将落入本发明的保护范围。
[0036] 实施例1 按照常规方法制备本实施例的原位杂交试剂盒，该试剂盒包括以EPHA1基因为检测目 的基因设计的杂交探针、标记物、说明书，其中： 本实施例的探针标记物选用地高辛。
[0037]试剂盒杂交液组成： 消化液 100yL/管1管/盒无色透明液体 保护液 1〇〇uL/管1管/盒无色透明液体 预杂交液1300yL/管2管/盒无色透明液体 正义杂交液10uL/管1管/盒无色透明液体 反义杂交液10yL/管1管/盒无色透明液体 封闭液 1〇〇〇uL/管1管/盒无色透明液体 碱性磷酸酶抗体1uL/管 1管/盒无色透明液体 显色剂A175yL/管1管/盒黄色液体 显色剂B320yL/管1管/盒无色透明液体 缓冲液I90mL/瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体 缓冲液II80mL/瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体 缓冲液III20mL/瓶3瓶/盒浅黄色或无色透明液体 缓冲液IV90mL/瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体 固定液 90mL/瓶1瓶/盒无色透明液体 阳性对照标本6片/盒。
[0038] 配制试剂使用浓度 1) .将10X缓冲液I用三蒸水按1:10稀释成1X缓冲液I; 2) .将20X缓冲液II用三蒸水按1:10稀释成2X缓冲液II; 按1:100稀释成0. 2X缓冲液II;按1:200稀释成0. 1X缓冲液II; 3) .将10X缓冲液III用三蒸水按1:10稀释成IX缓冲液III; 4) . 10X缓冲液IV用三蒸水按1:10稀释成X缓冲液IV(取1#，2#，3#各10mL，加水 至100mL既可）。
[0039] 实施例2 应用核酸原位杂交检测方法对老年性痴呆患者EPHA1基因表达的实施过程： 1) .取待测标本两张； 2) .在玻璃缸里加入消化液（消化液100yL加IX缓冲液I99. 9ml，即为使用浓度）50 ml，37°C水浴预热10min，放进16张玻片，37°C处理12min,再用IX缓冲液I洗5min; 3) ?用0? 2%的保护液（保护液lml加1X缓冲液I，99ml即为使用浓度）洗10min， 三蒸水洗5min(以上过程都在玻璃缸进行)，取出玻片，让其自然干燥； 4) .将玻片放入保湿盒内，加预杂交液25iiL/片（加在有细胞的地方)，盖上盖玻片， 盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中3h以上； 5) .取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内，用70%、90%、95%的乙醇各洗2min， 取出，自然干燥； 6) .将玻片放入保湿盒内，一张加正义杂交液25yL/片，另一张加反义杂交液25yL/ 片，盖上盖玻片，盖紧保湿盒，放在42°C恒温水浴箱中16-24h; 7) .取出玻片，弃去盖玻片，将玻片放入玻璃缸内： 在42°C恒温水浴箱中用2X缓冲液II洗两次，每次15min; 在42°C恒温水浴箱中用0. 2X缓冲液II洗一次，每次15min; 在42°C恒温水浴箱中用0.IX缓冲液II洗两次，每次15min; 8) .用IX缓冲液III洗30s，取出玻片，自然干燥； 9) .将玻片放入保湿盒内，加〇? 5%封闭液（lml封闭液加5ml1X缓冲液III) 100UL/ 片，盖紧保湿盒，在室温下作用30min。（此步骤不需加盖玻片）； 10) .取出玻片，用IX缓冲液III洗30s，自然干燥； 11) .将玻片放入保湿盒内，加X-AP抗体（取一管碱性磷酸酶抗体，向其中加入1. 8ml 1X缓冲液III) 100UL/片，盖紧保湿盒在室温下作用30min，时间不能过长，否则会产生假 阳性(此步骤不需加盖玻片）； 12) .取出玻片，用IX缓冲液III洗3次，每次15min; 13) .用IX缓冲液IV洗2min，加显色剂（显色剂A73. 3iiL，显色剂B157. 5iiL加到 30mL1X缓冲液IV中，混匀），室温避光16h到18h以上； 14) .用三蒸水洗5min，自然干燥，（用甘油加10%的1X缓冲液I混匀）封片镜检。
[0040] 本发明的核酸原位杂交检测方法将目的基因用地高辛标记，成为RNA核酸探针， 将探针与人体白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，因此在光镜下 观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。
[0041] 老年性痴呆病人20名，55岁以上人群20名，正常对照组20名。抽所有待检人的 外周血3-5毫升(分离白细胞）做原位杂交。结果表示，所有老年性痴呆患者EPHA1基因有 过度表达，细胞染色深；高危人群（55岁以上）有一定量表达（20%左右）；正常对照人零表 达，涂片细胞不染色。结果见图2、图3和图4。
【主权项】
1. 一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物，其特征在于，所述的杂交探针序 列如SEQIDNO. 1所示。
2. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述的标记物选自放射性物质、化学发光 或显色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
3. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括杂交液。
4. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括增效剂。
5. 如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括显色剂。
6. -种EPHA1基因原位杂交检测方法，其特征在于，该方法包括以下步骤： (1) 在权利要求1所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物 中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和 (2) 检测所述杂交复合体。
7. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的可形成稳定杂交复合体的条件 为：核酸杂交的温度为42°C;核酸杂交的时间为16 - 24小时。
8. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的底物选用人的血液白细胞和脑 脊液细胞标本。
9. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于，所述的标本是老年性痴呆患者、高危人 群、正常对照人群。 10. EPHA1基因在制备检测老年性痴呆病变前期原位杂交试剂盒中的应用。
【专利摘要】本发明公开一种原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针和标记物。还公开使用本试剂盒原位杂交检测与老年性痴呆（Alzheimer’sDisease-AD）前期病理演变有密切相关的EPHA1基因mRNA的方法，包括以下步骤：（1）在杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和（2）检测所述杂交复合体。本发明的试剂盒和检测方法可以在，mRNA水平上检测EPHA1基因的表达功能，比现有的临床生化检测指标和影像医学检查更早期，能实现真正的老年性痴呆（AD）病变前期mRNA水平的筛查，做到预防性诊治的目的。同时，本发明的检测方法简单方便，成本低,便于医院推广应用。
【IPC分类】C12Q1-68
【公开号】CN104711323
【申请号】CN201310669551
【发明人】张玉丽, 裘建英, 张云福, 裘霖
【申请人】芮屈生物技术（上海）有限公司
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2013年12月11日