学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
[0012] 原位杂交的探针是已知序列的分子或序列未知但分子已知的核酸分子（虽不明确 该分子全部序列，但已知其针对何靶分子)，探针的种类按核酸性质不同又可分为DNA探针、 cDNA探针、cRNA探针和合成寡核苷酸探针。为了便于示踪，探针必须用一定的手段加以标 记，以利于以后的检测。常用的标记物包括放射性核素和非放射性标记物两大类。常用的 同位素标记物有 3H、35S、125I和32P。同位素标记物虽然有灵敏性高、背底较为清晰等优点，但 是由于放射性同位素对人和环境均会造成伤害，近来有被非同位素取代的趋势。非同位素 标记物中目前最常用的有生物素、地高辛和荧光素三种。检测这些标记物的方法都是极其 灵敏的。
[0013] 根据所用探针及所要检测核酸的不同又可分为DNA-DNA,RNA-DNA,RNA-RNA杂交。 但不论哪一种形式的杂交，都必须经过五大过程，即组织细胞的固定，预杂交、杂交、冲洗和 显示。本发明采用RNA-RNA的杂交方式，合成的探针（mRNA)和检测的靶mRNA是采用碱基 互补（杂交互补）的原理，同时经过长时间研究和观察，启动和中止处得残基对检测的结果 没有影响（因为，发明人采用的mRNA序列都超过600bp以上，而对于较长的碱基序列，超过 lOOObp以上，我们会选择该基因的⑶S来做探针，如果⑶S的碱基序列长度也超过lOOObp 以上，我们会选择其中一段碱基序列来合成探针，但要经过Blast分析机体中是否有相同 碱基序列片段存在)。
[0014] 本发明的初衷是想改变目前临床上重大疾病的诊治模式，从治已病变成预防性治 未病，达到预防性诊治，将目前影像医学手段和众多生化标记物无法检测到老年性痴呆病 理演变前期mRNA水平量化改变技术，做了创新性的技术突破，提供老年性痴呆前变mRNA水 平筛查技术。使临床上有了一项新的老年性痴呆病理演变前期mRNA水平真正早期筛查的 技术，为临床老年性痴呆症的早期预防和治疗争取时间和空间。
[0015] 综上所述，本发明的目的首先是提供一种原位杂交检测试剂盒，其包含原位杂交 检测探针和标记物。
[0016] 其次，本发明还要提供上述试剂盒用于与老年性痴呆病理演变前期的EPHA1基因 的原位杂交检测方法。
【发明内容】
[0017] 为实现本发明的目的，本发明的技术方案如下： 本发明首先提供一种原位杂交检测试剂盒，其包括杂交探针和标记物，其中，所述的杂 交探针序列如SEQIDNO. 1 所示，是EPHA1 基因CDS中（88...3018bp),从 901...1320bp的 一段，探针长420bp，与体内的靶片段进行反向互补杂交)。EPHA1基因全长3369bp，位于染 色体7q34"上。
[0018] 本发明试剂盒的一个优选方案是，所述的标记物选自放射性物质、化学发光或显 色物质、生物素、金属鲎、荧光素、酶及纳米材料。
[0019] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括杂交液。
[0020] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括增强剂。
[0021] 本发明试剂盒的一个优选方案是还包括显色剂。
[0022] 本发明的老年性痴呆病理演变前期基因筛查试剂盒应用价值在于，能在mRNA水 平，及早对老年性痴呆病理演变前期的筛查及老年性痴呆症经治疗后疗效的评判。EPHA1基 因是一种老年性早衰基因，它的表达变化表明老年性痴呆症前期病理演变的可能，提示临 床医生及早介入预防和治疗。
[0023] 本发明还提供一种EPHA1基因原位杂交的检测方法，包括以下步骤： (1) 在上面所述的杂交探针与靶序列可形成稳定杂交复合体的条件下，将底物中待测 RNA与杂交探针接触，形成杂交复合体；和 (2) 检测所述杂交复合体。
[0024] 本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的可形成稳定杂交复合体的条件为： 核酸杂交的温度为42°C;核酸杂交的时间为16-24小时。
[0025] 本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的底物选用人的血液白细胞标本或 其它器官组织细胞、或脑脊液标本。更优选地是，所述的血液标本或其它器官组织细胞标本 来自老年性痴呆患者、高危人群，正常人群。
[0026] 本发明所述的检测方法，其中优选地是，所述的高危人群、老年性痴呆症好发家 族、经治疗后老年性痴呆症病人。
[0027] 本发明的检测试剂盒是采用核酸杂交技术和组化免疫方法相结合，以EPHA1基因 为检测对象，合成探针是EPHA1基因的RNA序列，检测的底物是人体血液标本白细胞或组织 细胞及脑脊液的RNA的表达量。原位杂交技术的显示方法能提供EPHA1基因的半定量或定 量表达程度判定。根据杂交后免疫组化显色判定以上基因的表达量，正常人EPHA1基因表 达低或不表达，即不显色，EPHA1基因在老年性痴呆病人和正常人有显着差异，该基因的表 达量比正常人表达量都高，高度显色。
[0028] 本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括： 1) .将待测标本放入反应槽中； 2) .仪器自动弃去液体，自动加消化液； 3) .仪器自动弃去液体，自动后固定； 4) .仪器自动弃去液体，自动预杂交（42°C); 5) .仪器自动弃去液体，自动清洗； 6) .仪器自动弃去液体，自动杂交（42°C); 7) .仪器自动弃去液体，自动清洗； 8) .仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温）； 9) .仪器自动弃去液体，自动清洗，显色； 10) .取出封片镜检。
[0029] 本发明的一个优选实施例的方案是：以EPHA1基因为目的基因合成的核酸探针用 地高辛标记(地高辛标记的cDNA、RNA和寡核苷酸探针，不但探针的具有生物素标记优点， 还克服了生物素标记的探针在原位杂交过程中受组织内源性生物素干忧等缺点)，将该杂 交探针与人体血液白细胞的待测RNA核酸进行杂交，再用免疫组化的方法显色，在光镜下 观察mRNA的存在和定位，根据染色的细胞数，判断目的基因的表达量。
[0030] 本发明方法是目前常用的核酸原位杂交技术，该方法通过检测底物细胞中的 EPHA1基因表达量，用来确定老年性痴呆病理演变是否已发生，因为EPHA1基因在正常人中 低表达或不表达，如果EPHA1基因表达高度，说明老年性痴呆发生风险非常高，以及治疗后 病人治疗效果评判，从而获得老年性痴呆前期的筛查和诊断信息，帮助临床医生及早介入。 一个试剂盒可以多人份使用或一人份使用。
[0031]如上所述，当检测到EPHA1基因的表达高于正常对照时，则可预测受试者老年性 痴呆病理演变已发生。
[0032] 本发明具有如下有益效果： 本发明的临床意义是更早期跟踪检测老年性痴呆病变发生和病理演变过程中老年性 痴呆症的发生、发展趋势。本发明可以在基因水平上检测EPHA1基因异常表达，亦未形成老 年性痴呆之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床老年性痴呆病理演变前 期高风险人群，一个真正的早期筛查以及治疗后疗效判定。这样才有可能实施老年性痴呆 的早期筛查、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底根治老年性痴呆这一恶疾。
[0033]此外，本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点，同时，本发明的检测 方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
【附图说明】
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