专利名称：一种编码过氧化氢酶的基因及其制备方法和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种编码过氧化氢酶的基因及其制备方法和应用。
背景技术：
过氧化氢酶(CAT)是一种蛋白类清除剂，是以铁卟啉为辅基的结合酶。它能促使 H2O2分解为分子氧和水而清除体内的过氧化氢，从而使细胞免受H2A的毒害，是生物防御体系的关键酶之一。氧自由基的清除可以分为两步第一步是作为有害物质的超氧阴离子在SOD的作用下和氢离子反应，生成H2A ；第二步是H2O2在过氧化氢酶的作用下和氢离子反应，最终将H2A降解成H2O和02。事实上，SOD、GSH、维生素E、CAT等是一个相互保护的防御群。当自由基代谢出现紊乱时，抗氧化酶含量降低而引起机体受损。适当补充外源性的抗氧化剂能提高机体的抗氧化能力，以免机体受到自由基的损伤。近年来，大量研究发现自由基与衰老、癌症、肺心病、肾病等多种疾病有关，主要在几个病理过程的启动中起重要作用。机体主要通过去自由基酶(如S0D、CAT等)来清除体内自由基，使机体免受自由基损伤。彭志英和蒋黎(19%)的研究表明过氧化氢酶正是能够迅速分解H2A生成H2O和02，使超氧化物酶水解反应顺利进行，同时使H2A不至于与02_在铁鳌合物的作用下反应生成0H—自由基，而防止自由基的损伤。去自由基酶在健康和疾病中的作用正在被人们关注，检测该类酶对研究自由基代谢平衡、抗衰老及肿瘤发病机理，以及急性胰腺炎、肝炎、心血管疾病、各种贫血与Zieve综合症等的诊断与鉴别诊断具有重要意义(Southern and Powis, 1988; Cohen, 1989)。此外，过氧化氢酶还可充当Hb和其它含巯基蛋白质的保护剂。过氧化氢酶主要与细胞内线粒体及过氧化物酶体结合，同D-氨基酸氧化酶等一系列需氧脱氢酶相偶联并快速分解细胞代谢过程中产生的毒性物质H2O2，从而起到解毒、保护巯基酶和膜蛋白等作用(王坤等，1989)。从发现至今，对过氧化氢酶的研究已愈百年，对该酶的理论与应用研究均有一定的深度。近几年随着工农业生产技术的进步及需求，过氧化氢酶获得广泛的应用，其主要应用领域主要有①在食品工业中的应用；②在制浆造纸和纺织印染工业中的应用；③在医药中的应用。在医药领域，CAT的应用已经获得进展。如含有过氧化氢酶的滴眼液和隐形眼镜护理液可以有效的去除晶状体内的H2O2，有效的预防和延缓白内障的发生；补充过氧化氢酶可以有效的抑制刺激部位平滑肌细胞的异常增殖的现象；近年来，过氧化氢酶开始使用在美容业中。一些面部护理中加入了该酶和过氧化氢，目的是增加表皮上层的细胞氧量。由于几乎所有的疾病的发生和发展都与自由基的积累有关系，所以研究人员已经在尝试将过氧化氢酶用于动物活体细胞的功能研究，如血管上皮细胞，肌细胞，晶体细胞等，并取得了一定的进展。一些蛋白质能以非传统的内化方式跨膜进入细胞，而且这些蛋白还能将更大的分子带入到细胞内部，甚至逾越血脑屏障。研究发现，这类蛋白都有共同特性的能介导蛋白跨膜转运的结构域——蛋白转导结构域(Protein transduction domain,PTD)0具有跨膜递送活性的PTD蛋白核心序列(YGRKKRRQRRR)的多肽片段即被确定为TAT蛋白转导域，简称 PTD-TAT。PTD-TAT区段(protein transduction domain)能够高效地将多种不同结合形式的大分子颗粒带进体外培养的细胞，并不会导致携带物生物学活性的丧失。CAT现已经成为一种疗效广泛的药用酶，但仍有一些缺陷，如天然酶分子量大且难透过细胞膜、稳定性较差、体内半衰期短、且具有免疫原性、功能相对单一等，使其在临床上的应用仍有一定的困难，从而限制了其应用。对于CAT-TAT融合蛋白研究有利于进一步拓宽其应用范围。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了一种编码过氧化氢酶的基因及其制备方法和应用。通过使用该基因表达得到了 CAT-TAT蛋白，实现CAT-TAT的生产产业化，获得具有良好稳定性的CAT-TAT产品，用于提高细胞内的过氧化氢酶活性。本发明首先提供了一种编码过氧化氢酶的基因，该基因的核苷酸序列如SEQ NO. 1 所示。其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。其次提供了一种载体，包含所述的编码过氧化氢酶的基因。还提供了一种细胞，包含上述的载体。所述细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。本发明另外提供了一种编码过氧化氢酶的基因的制备方法，包括以下步骤从人肝脏细胞中分离提取总RNAJf mRNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增，根据NCBI发表的人 CAT基因序列设计引物Pl和P2，分别含有MfeI和Viz^III酶切位点，用于大肠杆菌质粒的构建；或设计引物P3和P4分别含有和I酶切位点，用于酵母质粒的构建；其中引物P2或P4含有编码蛋白转导域TAT的9个氨基酸RKKRRQRRR的基因序列；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因；制备好的双链cDNA进行亚克隆将所得目的基因进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到CAT-TAT基因。所述引物Pl、P2、P3、P4 的序列如 SEQ NO. 3, SEQ NO. 4, SEQ NO. 5, SEQ NO. 6 所不。本发明还提供了所述编码过氧化氢酶的基因的应用，所述基因分泌的CAT-TAT蛋白能以体外给药的方式提高细胞内的过氧化氢酶活力。本发明详述如下
本发明涉及从人肝脏细胞中克隆的CAT基因。本发明涉及从人肝脏细胞中克隆的CAT-TAT的编码序列。实施方式之一，本发明提取人肝脏细胞L-02的总RNA，通过RT-PCR和PCR的方法克隆到编码CAT的全长序列以及CAT-TAT融合基因。实施方式之一中，所述编码序列包含如SEQ NO. 1所示的核酸序列， 称之为CAT-TAT。实施方式之一中，所述编码序列是SEQ NO. 1中的核苷酸1至1608bp所示的核苷酸序列。本发明还涉及包含所述CAT-TAT编码序列的重组载体，例如由各种本领域常用的表达载体制备的重组载体，其中，所述编码序列不包含其来源微生物的内源性信号肽序列。实施方式之一中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明CAT-TAT编码序列经MfeI和 Λ /7 /ΙΙΙ双酶切后与MfeI和历/^ III双酶切的pET21a(+)载体连接，得到大肠重组表达载 pET21a(+)-CAT-TAT0另一实施方式中，将不带内源性信号肽编码序列的本发明CAT-TAT编码序列经机和Not\双酶切后与Sft^I和Afoi I双酶切的pPICTk载体连接，得到酵母重组表达载体pPIC9k-CAT-TAT。本发明还制备包含本发明CAT-TAT编码序列的细胞。实施方式之一中，所述细胞是用上述本发明重组载体转化来构建的。所述细胞优选各种利于基因产物表达或发酵生产的细胞，此类细胞已为本领域熟知并常用，例如各种大肠杆菌细胞和酵母细胞。在本发明的实施方式之一中，选用大肠杆菌Rosetta2(DE;3)和毕赤酵母GS115构建表达CAT-TAT的重组细胞。本发明还提供了表达CAT-TAT的方法，包括培养前述包含CAT-TAT编码序列的细胞或所述经转化的细胞，诱导其表达，收获表达产物，还可以可行性地包括纯化表达产物的步骤。实施方式之一中，本发明通过包含本发明CAT-TAT编码序列的酵母(例如毕赤酵母GS1K)发酵来生产CAT-TAT，并通过硫酸铵沉降，离子交换层析和凝胶层析纯化得到了纯酶形式的目的蛋白。本发明利用基因工程手段制备了能够高效表达并分泌CAT-TAT融合蛋白，实现了 CAT-TAT的生产产业化，并获得了优质的CAT-TAT产品。本发明通过融合蛋白酶学性质鉴定进行了酶的最适作用温度、最适作用PH值、金属离子稳定性等理化性质的分析，证明本发明的CAT-TAT重组蛋白最适反应温度为40°C，最适反应pH为6. 5 ；CAT-TAT融合蛋白通过体外给药实验，表明TAT蛋白转导域融合的CAT蛋白能明显提高细胞内的过氧化氢酶活性。
图1人源CAT-TAT在质粒pET21a(+) (A)和pPIC9k (B)上的重组子结构图。图2人源CAT和CAT-TAT在大肠杆菌中表达的SDS-PAGE。图3毕赤酵母表达人源CAT-TAT发酵过程中的酶活力。图4毕赤酵母表达人源CAT-TAT发酵过程中样品的SDS-PAGE。图5毕赤酵母表达人源CAT-TAT的分子量。图6毕赤酵母表达人源CAT-TAT的最适反应pH。图7毕赤酵母表达人源CAT-TAT的最适反应温度。图8毕赤酵母表达人源CAT对对细胞内CAT活性影响。
具体实施例方式以下根据具体的实施例充分说明本发明。 实施例实验材料和试剂 1.菌株和载体
大肠杆菌 Rosetta2 (DE3)、JDH5 α 及表达载体 pET21a(+)购自 Novagen 公司；pMD_18T Vector购自Takara公司；毕赤酵母GS115及表达载体pPIC9k均购自hvitrogen公司 (Carlsbad, CA, USA)。2.酶类及其他生化试剂
限制性内切酶、DNA Maker、蛋白质Maker均购自i^ermentas (MBI)，CAT检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所，其他常规试剂为上海生工或进口。3.培养基
使用的培养基:LB培养基，YPD，YPAD, BMDY, BMMY, MM, MD培养基均参照hvitrogen毕氏酵母操作手册。4.本发明中所用到的生物化学技术均为本领域中的常规技术。在以下实施例中， 除非特殊说明，所有实验操作均按照以下实验手册或文献中的相关章节或部分进行，包括 [美]J.莎姆布鲁克等，分子克隆实验指南；赵永芳等，生物化学技术原理及其应用(第二版)；朱检等，生物化学实验[M]。5.本发明中所有相关的酶活、酶活力、酶活性均是指CAT酶活性，均采用CAT检测试剂盒(购自南京建成生物工程研究所)，并按照其说明书中所述的方法进行测定及计算。实施例1 CAT及CAT-TAT基因的克隆
(1)总RNA的分离提取
(2)cDNA第一链的合成
反转录成第一链 cDNA 参照(First-straind cDNA Synthesis KIT)产品说明，在 20ul 体系中，加入 lug 总 RNA、lul Oligo dT18 (500ug/ml)和 foiase-free 水，在 70°C水浴温育 IOmin后，立即置于冰浴冷却；继续向冷却的管中加入4ul 5XBuffer、2ul 0. IM的DTT和 Iul IOmM的dNTPs，混勻后于42°C水浴保温^iin ；再加入Iul (200U)反转录酶，42°C继续保温50min ；最后，置于70°C水浴保温15min，灭活反转录酶，获得第一链cDNA。实验过程中设置不加RNA的阴性对照。(3) PCR获取目的基因
根据NCBI发表的人CAT基因序列设计引物=PKSEQ NO. 3)和P2(SEQ NO. 4)，分别含有 MfeI 和历'/ /ΙΠ酶切位点，用于 pET21(a+)质粒的构建；P3 (SEQ NO. 5)和 P4 (SEQ NO. 6)， 分别含有Sffi^I和Λ^ I酶切位点，用于pPICTk质粒的构建；P2和P4均含有编码蛋白转导域TAT的9个氨基酸RKKRRQRRR的基因序列。所述引物均由上海生工合成，引物序列如下
Pl :5， CATATG GCTGACAGCCGGGATCCCG 3，，
P2 :5， GGAAGCTTTCATCTTCTTCTTTGTCTTCTCTTCTTTCTCAGATTTGCCTTCTCCCTTG 3，； P3 :5’ TACGTAGCTGACAGCCGGGATCCCG 3’，
P4 :5， GCGGCCGCTTATCTTCTTCTTTGTCTTCTCTTCTTTCTCAGATTTGCCTTCTCCCTTG 3，。本实施例PCR程序为94°C预变性％iin;94°C变性30s，60°C退火30s，72°C延伸 2min，循环扩增30次；最后72°C延伸lOmin。扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因。得到产物P1-P2和产物P3-P4.
制备好的双链cDNA P1-P2和P3-P4插入到载体系统pMD_18T vector上，分别将连接物转入制备好的DH5a感受态细胞，涂LB平板(含lOOug/ml氨苄青霉素)，37°C培养箱培养过夜，挑取在抗性平板上生长的阳性克隆子接入anl LB培养基中(含lOOug/ml氨苄青霉素)，37°C培养过夜；收集培养液，IOOOOrpm室温离心Imin收集菌体，用质粒提取试剂盒 (上海生工)提取质粒；质粒分别经限制性内切酶MfeI和历/^III /SnaB I和Λ^ I进行酶切，酶切产物经核酸电泳检测；挑取阳性克隆PMD-18T-CAT-TAT1和pMD_18T-CAT_TAT2用 M13F(5，CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC 3，)和 M13R(5，AGCGGATAACAATTTCACACAGGA 3，)弓丨
6物进行测序(上海英俊公司)，测序采用Sanger测序方法。pMD-18T-CAT-TATl 和 pMD-18T_CAT_TAT2 的测序结果是，CAT-TAT 的编码序列共有 1608bp (SEQ ID NO. 1),编码人源过氧化氢酶与蛋白转导TAT的融合蛋白(SEQ NO. 2)。其中第1606-1608位为终止密码子TAA ；第1-1578位编码不含信号肽的成熟人过氧化氢酶蛋白，共5 个氨基酸；与黑猩猩等来源的过氧化氢酶有较高的同源性；第1579-1606为蛋白转导域TAT的9个氨基酸RKKRRQRRR的基因序列。
实施例2 CAT-TAT编码基因在大肠杆菌中的表达
将实施例1 - (4)中所得到的质粒pMD-18T-CAT-TAT1经Nde I和Hind III双酶切得到 CAT-TAT片段，与经过MfeI和历^iZIII双酶切的pET21a(+)质粒连接，将连接物转入制备好的感受态细胞DH5a中，经蓝白斑筛选，提质粒鉴定(方法同实施例1)，得到重组质粒 pET21a(+)-CAT-TAT (如图 IA所示)。取Iul构建好的重组质粒pET21a(+)-CAT_TAT，加入到IOOul制备好的感受态细胞(大肠杆菌ROSetta2(DE;3))中，涂LB平板(含lOOug/ml氨苄青霉素)，37°C培养箱培养过夜，挑取在抗性平板上生长的阳性克隆子接入anl LB培养基中(含lOOug/ml氨苄青霉素)，37°C 250rpm振荡培养过夜，次日按1%转接至50ml LB培养液中(含100ug/ml Amp) 培养1. 5-2h至OD600=O. 6，加入IPTG诱导(终浓度为2umol/ml), 30°C 250rpm再振荡培养 3-3.证。取培养液IOOOOrpm离心lOmin，收集菌体，再加入等体积的无菌水重新悬浮菌体， 12000rpm离心lOmin，取沉淀用1/5体积pH6. 0，50mM的PBS悬浮菌体，进行超声波破碎，破碎条件为60%功率，间隔5s破碎lOmin，停止lOmin，再破碎lOmin。12000rpm离心，收集上清液分析CAT-TAT活力，并通过SDS-PAGE电泳分析目的蛋白的表达量，结果表明CAT-TAT 的编码基因所编码的CAT-TAT可在大肠杆菌中表达，且有一定的CAT活性。(图2)
实施例3 CAT-TAT编码基因酵母重组表达载体的构建
将实施例1-(4)中所得到的质粒pMD-18T-CAT-TAT2，用I和AfoiI进行酶切，酶切样品经核酸电泳检测并用胶回收试剂盒(上海生工)回收目的基因。与黾SnaB I和彻《 双酶切的PPirak质粒经T4连接酶16°C水浴连接池，连接物转入DH5 α (方法同实施例1)。 挑取抗性菌株培养，并提取质粒，质粒经I和彻《进行酶切，核酸电泳检测，得到重组质粒pPIC9k-CAT-TAT (如图IB所示)。以所得pPIC9k-CAT_TAT重组质粒为模板，以CAT-TAT的特异性引物P3和P4，进行PCR扩增，扩增程序同实施例1。扩增产物经核酸电泳检测可见一条约I600bp的条带， 与目的片段的大小一致。并将该重组质粒PPICTk-CAT-TAT行测序，测序引物为a-factor Primer 禾口 3' AOXl Primer。α -factor Primer :5’ TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3’ 3' AOXl Primer 5' GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'
测序结果与SEQ NO. 1 一致，表明CAT-TAT在pPICTk中插入位点、方向、序列和阅读框均正确，即pPIC9k-CAT-TAT表达质粒构建成功。实施例4毕赤酵母发酵制备重组CAT-TAT
大量提取实施例3的重组质粒pPIC9k-CAT-TAT约5ug，用Sal I酶切，得到线性化的 pPIC9k-CAT-TAT 质粒。
提取毕赤酵母GS115单菌落于YPD培养基中培养箱中，培养至菌密度达到 OD600=L 3。取Iml的该菌液于1. 5ml无菌离心管中冰浴IOmin后，于1500g，4°C离心机离心 5min ；弃上清，加入Iml冰浴的无菌水，轻轻将细胞悬起，后置1500g，4°C离心机离心5min ； 重复一次；弃上清，加入Iml冰浴的SorbitaKl M)，轻轻将细胞悬起，后置1500g，4°C离心机离心5min ；重复两次；弃上清，加入100 ul冰Sorbital (1 M)。将上述细胞转入0. 2cm的电转杯中，加入线性化的pPICTk-CAT-TAT质粒，混勻，置于冰上5min，用电转仪(Bio-Rad MicroPulser )进行电击(电击电压2. OkV;时间常数 5. 8ms)，电击后迅速加入Iml Sorbital (1 M)，混勻取菌液200ul涂布RD板，30°C培养箱倒置培养3-4天，长出his+重组子。挑出长出来的单菌落，于YPD液体培养基培养过夜，按0D_=1. O转接于小摇瓶(IOml BMMY培养基)，以甲醇为诱导剂诱导AOX基因表达，每Mhr取样，取样同时补加甲醇至终浓度1%.诱导168hr样品离心，取上清，测定CAT活性，并进行SDS-PAGE电泳分析， 结果分别如图3和图4所示。发酵达72hr时，样品的CAT活性最高达到^OU/ml，相应菌密度达到0D6(i(i=35.这说明重组CAT-TAT融合蛋白在毕氏酵母中得到了表达和积累。实施例5重组CAT-TAT的纯化
将实施例4所制备的发酵培养液IOOOOrpm离心IOmin去除菌体，取上清液作为粗酶液，将粗酶液置于冰浴中，边搅拌边缓慢加入硫酸铵至50%，13000rpm离心15min，取沉淀， 用缓冲液(Tris-HCl，pH8.0，50mM)重新溶解。将以上溶解后的样品，经13000rpm离心15min，取上清上脱盐柱冊-558(01.6\100011)，先用501111 Tris-HCl缓冲液pH8. 0平衡柱子，然后上样，流速为 1. 0 ml/min，用部分收集器收集样品，然后对收集的样品测定CAT活性，并进行蛋白质电泳分析。取上述的目的蛋白峰样品，用于SuperQ 650C阴离子交换色谱，先用50mM pH8. 0， Tris-HCl缓冲液平衡柱子，然后样品上样，再用平衡液冲平，流速为lml/min。待冲平后，再用相同缓冲液配置的0-lmol/L NaCl梯度洗脱5个柱体积，分布收集样品，测定CAT活性， 并进行蛋白质电泳分析。取离子交换色谱后的目的蛋白峰样品，上Tsk-G3000SW凝胶过滤柱。先用50mM PH8.0, Tris-HCl平衡柱子，然后上样，流速为1.0 ml/min，用部分收集器收集样品，然后对收集的样品测定CAT活性，并进行蛋白质电泳分析。SDS-PAGE结果(图5)表明，重组人源CAT-TAT融合蛋白经纯化后，以达到电泳纯， 其分子量约为66kDa。CAT活性从粗酶液的^OU/mg提高到纯酶的6400U/mg，纯化倍数为 34. 9 倍。实施例6重组CAT-TAT的酶学性质分析
将实施例5所制备的CAT-TAT纯融合蛋白在不同的pH下进行酶促反应以测定其最适PH。所用缓冲液的pH范围为5. 0-9.0 (pH4. 0-6.0范围内采用50mM Gly-HCl缓冲液， pH6. 5-9. 0采用50mM Tris-HCl缓冲液)。CAT-TAT纯融合蛋白在不同的pH的缓冲液中， 37°C下测定pH的适性结果，表明人源CAT-TAT融合蛋白从pH5. 0至6. 5酶活力迅速升高， 在中偏酸性的PH具有较高的酶活，在pH为6. 5是酶活力达到最高(100%)，pH在6. 5-9. 0 之间酶活力缓慢降低，在PH9. 0时仍能保持70%以上的酶活力(图6)。
最适反应温度的测定在Tris-HCl (pH6. 5，50mM)缓冲体系及不同温度下、 20 V、25 °C、30 V、；35 °C、40 V、45°C、50 V、55°C、60 V >65°C 进行酶促反应。热稳定性研究为在不同温度下处理60min，再进行酶活性测定。酶促反应最适温度测定结果(图7)表明， CAT-TAT过氧化氢酶融合蛋白在4-25° C之间相对酶活平缓，从30-40° C之间相对酶活迅速上升，之后又开始迅速下降，65°C时仅保留不到20%的酶活力，最适反应温度为45-55°C。在Tris-HCl (pH6. 5，50mM)缓冲液中加入终浓度为ImM的金属盐溶液和抑制剂 (Ca2\Mn2\Zn2\Al3\Pb2\Fe3\Fe2\Mg2\K\ Cu2+、Hg+、2-Mercaptoethanol、EDTA)，在 40°C 的水浴中保温30min后，在37°C下测定残留的CAT活性。由表1可知，Mn2+、Fe3+、Fe2+、Mg2+ 等对CAT-TAT融合蛋白的过氧化氢酶活力有一定的促进作用；Al3+、2-MerCaptoethanol、 EDTA等对CAT-TAT融合蛋白的过氧化氢酶活力有明显的抑制作用。
表1金属离子及其他抑制剂对CAT-TAT酶活性的影响
权利要求
1.一种编码过氧化氢酶的基因，其特征在于该基因的核苷酸序列如SEQ NO. 1所示。
2.根据权利要求1所述的编码过氧化氢酶的基因，其特征在于其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ NO. 2所示。
3.一种载体，包含权利要求1或2所述的编码过氧化氢酶的基因。
4.一种细胞，包含权利要求3所述的载体。
5.根据权利要求4所述的细胞，其特征在于所述细胞为大肠杆菌细胞或酵母细胞。
6.一种如权利要求1或2所述的编码过氧化氢酶的基因的制备方法，其特征在于从人肝脏细胞中分离提取总RNA，将mRNA反转录为cDNA，再进行PCR扩增，根据NCBI发表的人CAT基因序列设计引物Pl和P2，分别含有MfeI和Viz^III酶切位点，用于大肠杆菌质粒的构建；或设计引物P3和P4分别含有和I酶切位点，用于酵母质粒的构建；其中引物P2或P4含有编码蛋白转导域TAT的9个氨基酸RKKRRQRRR的基因序列；扩增结束后取PCR产物进行电泳检测，并回收凝胶中的目标基因；制备好的双链cDNA进行亚克隆将所得目的基因进行DNA序列测定，并在NCBI数据库中进行比对分析，得到CAT-TAT基因。
7.根据权利要求6所述的编码过氧化氢酶的基因的制备方法，其特征在于所述引物Pl、P2、P3、P4 的序列如 SEQ NO. 3、SEQ NO. 4、SEQ NO. 5、SEQ NO. 6 所示。
8.—种如权利要求1或2所述的编码过氧化氢酶的基因的应用，其特征在于所述基因分泌的CAT-TAT蛋白能以体外给药的方式提高细胞内的过氧化氢酶活力。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，更具体涉及一种编码过氧化氢酶的基因及其制备方法和应用。本发明的一种编码过氧化氢酶的基因，该基因的核苷酸序列如SEQNO.1所示。本发明从人肝脏细胞中克隆的CAT-TAT的编码序列。首先提取人肝脏细胞L-02的总RNA，通过RT-PCR和PCR的方法克隆到编码CAT的全长序列以及CAT-TAT融合基因。通过使用该基因表达得到了CAT-TAT蛋白，实现CAT-TAT的生产产业化，获得具有良好稳定性的CAT-TAT产品，用于提高细胞内的过氧化氢酶活性。
文档编号C12N15/63GK102559714SQ20121002146
公开日2012年7月11日 申请日期2012年1月31日 优先权日2012年1月31日
发明者刘树滔, 李仁宽, 饶平凡 申请人:福州大学