一种特异性引物检测鼠源性成分的方法与流程

本发明属于动物源性成分检测技术领域，具体涉及一种特异性引物检测鼠源性成分的方法，利用特异性引物采用实时荧光定量PCR(聚合酶链式反应)法检测鼠源性成分。

背景技术：
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PCR(聚合酶链式反应)是利用DNA在体外95℃的高温时变性成单链，在60℃左右的低温时，引物与单链按碱基互补配对的原则结合，再调温度至DNA聚合酶最适宜的72℃反应温度，DNA聚合酶沿着磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互补链，基于聚合酶制造的PCR仪实际就是一个温控设备，能在变性温度、复性温度和延伸温度之间很好地进行控制；聚合酶链式反应是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，能够看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点是能将微量的DNA大幅增加，所以，无论是化石中的古生物或历史人物的残骸，还是几十年前凶杀案中凶手所遗留的毛发、皮肤或血液，只要能分离出一丁点的DNA，就能用PCR加以放大，进行比对；老鼠肉冒充价格昂贵的牛羊肉是一些利欲熏心的商家经常采用的恶劣手段，老鼠肉直接冒充牛羊肉或掺杂在牛羊肉制品中流入老百姓的餐桌，带来了极大的社会影响，对使用者造成巨大的人身伤害，这是因为老鼠自身携带多种病菌，本身就是多种传染病病原的储存宿主和主要传染源，同时，老鼠肉所含的铅和砷等有毒有害物质的含量也远高于其他肉类，直接食用会给人们带来极大的身体危害和疫病传染风险，轻则中毒，重则死亡；目前，尚没有鼠源性成分检测的国家标准或者行业标准，普通消费者乃至食药质监部门通过肉眼难以鉴别，且传统检测方法繁琐，耗时长。本发明旨在通过实时荧光定量PCR核酸检测技术，开发一种特异性引物检测鼠源性成分的方法，为鼠源性成分的检测提供技术支持，为标准方法的建立提供实验支撑，为打击肉类掺假提供有力的科学依据，具有良好的社会和应用前景。

技术实现要素：
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本发明的目的在于克服现有技术的不足，设计一种特异性引物检测鼠源性成分的方法，为鼠源性成分的检测提供技术支持，为标准检测方法的建立提供实验支撑，为打击肉类掺假行政执法提供有力的科学依据。

为了实现上述目的，本发明涉及的特异性引物检测鼠源性成分的方法的工艺过程分为特异性引物设计合成、DNA提取、反应体系建立、PCR扩增、鼠源性成分分析结果评价五个步骤：

(1)、特异性引物设计合成：根据Genba nk中鼠的线粒体细胞色素b(Cyt b)基因序列设计并合成特异性引物，特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’；

(2)、DNA提取：取鼠肌肉组织1g研磨成糜状，然后按照组织基因组DNA提取试剂盒使用说明操作，提取DNA，经核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的浓度为220ng/μL，纯度为1.85，用RNase/DNase-free(去RNA酶与DNA酶)H₂O将提取的DNA浓度稀释为5ng/μL，备用；

(3)、反应体系建立：以步骤(2)提取的DNA为模板，用特异性引物建立10μL的PCR反应体系，取体积为2μL和浓度为5ng/μL的DNA模板、体积为1μL和浓度为5μM的上游引物F、体积为1μL和浓度为5μM的下游引物R以及体积为5μL的2×Master mixture(2×反应混合物)，剩余部分用RNase/DNase-free H₂O补足，实现反应体系的建立，并设置平行试验；

(4)、PCR扩增：将步骤(3)建立的反应体系置于实时荧光定量PCR仪上，设置以下条件：①、模板变性：95℃-5min；②、QPCR扩增：95℃-20s，60℃-10s，72℃-10s，40个循环，在72℃时采集荧光信号；③、熔解曲线：95℃-5s，65℃to 97℃的速率为0.5℃/5s，1个循环；

(5)、鼠源性成分分析结果评价：测定并加权计算实时荧光定量PCR产物平均Cp值，Cp值小于33，熔解曲线显示有明显的单一主峰，无非特异性PCR产物，表明利用该特异性引物能够检测到鼠源性成分，且特异性和重复性良好。

本发明涉及的特异性引物根据Genbank(DNA序列数据库)中鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成的，特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’。

本发明涉及的特异性引物的特异性表现在溶解曲线图中只有明显的单一主峰，没有其他峰，对鼠源性成分有针对性，引物具有纯真性，主峰具有单一性，只能合成单一物质。

本发明涉及的特异性引物的碱基序列是由上海捷瑞生物工程有限公司合成的；实时荧光定量PCR仪为Roche(罗氏)生物科技公司生产的Light Cycler 480式实时荧光定量PCR；核酸蛋白分析仪为Biochrom(柏诺)有限公司生产的BioDrop-μLite式核酸蛋白分析仪；高速冷冻离心机是湖南湘仪实验设备有限公司生产的台式高速冷冻离心机；2×Master mixture为Roche(罗氏)生物科技公司生产的LightCycler480SYBR Green I Master；DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司生产的组织基因组DNA提取试剂盒。

本发明与现有技术相比，基于鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成了利用实时荧光定量PCR法检测鼠源性成分的特异性引物，能够实现对鼠源性成分定性检测的功效。

本发明的有益效果是提供利用实时荧光定量PCR检测鼠源性成分的引物，该引物具有良好的特异性和重复性，使得利用该引物进行的实时荧光定量PCR法检测鼠源性成分时的操作简便、耗时少、特异性高，避免了传统检测方法中取出扩增产物进行电泳鉴定时扩增产物造成的二次污染，为鼠源性成分的检测提供了新的途径。

附图说明：

图1为本发明实施例1涉及的溶解曲线图。

图2为本发明实施例2涉及的溶解曲线图。

具体实施方式：

下面通过实施例并结合附图对本发明做进一步描述。

实施例1：

本实施例涉及的特异性引物检测鼠源性成分的方法的工艺过程分为特异性引物合成、DNA提取、反应体系建立、PCR扩增、鼠源性成分分析结果评价五个步骤：

(1)、特异性引物设计合成：根据Genbank中鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成特异性引物，特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’；

(2)、DNA提取：取鼠肌肉组织1g研磨成糜状，然后按照组织基因组DNA提取试剂盒使用说明操作，提取DNA，经核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的浓度为220ng/μL，纯度为1.85，用RNase/DNase-free H₂O将提取的DNA浓度稀释为5ng/μL，备用；

(3)、反应体系建立：以步骤(2)提取的DNA为模板，用特异性引物建立10μL的PCR反应体系，取体积为2μL和浓度为5ng/μL的DNA模板、体积为1μL和浓度为5μM的上游引物F、体积为1μL和浓度为5μM的下游引物R以及体积为5μL的2×Master mixture，剩余部分用RNase/DNase-free H₂O补足，实现反应体系的建立；同时，设置三组平行实验；

(4)、PCR扩增：将步骤(3)建立的反应体系置于实时荧光定量PCR仪上，设置以下条件：①、模板变性：95℃-5min；②、QPCR扩增：95℃-20s，60℃-10s，72℃-10s，40个循环，在72℃时采集荧光信号；③、熔解曲线：95℃-5s，65℃to 97℃的速率为0.5℃/5s，1个循环。

(5)、鼠源性成分分析结果评价：经测定得到三组平行实验的Cp值分别为16.35、16.94和16.10，经加权平均计算得到Cp值为16.47，Cp值的标准差为0.430，熔解曲线如图1所示，有明显的单一主峰，且重合度良好，表明利用该引物能够检测到鼠源性成分，且特异性好。

本实施例涉及的特异性引物根据Genbank中鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成的，特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’。

本实施例涉及的特异性引物的特异性表现在溶解曲线图中只有明显的单一主峰，没有其他峰，对鼠源性成分有针对性，引物具有纯真性，主峰具有单一性，只能合成单一物质。

本实施例涉及的特异性引物的碱基序列是由上海捷瑞生物工程有限公司合成的；实时荧光定量PCR仪为Roche(罗氏)生物科技公司生产的Light Cycler 480式实时荧光定量PCR；核酸蛋白分析仪为Biochrom(柏诺)有限公司生产的BioDrop-μLite式核酸蛋白分析仪；高速冷冻离心机是湖南湘仪实验设备有限公司生产的台式高速冷冻离心机；2×Master mixture为Roche(罗氏)生物科技公司生产的LightCycler480SYBR Green I Master；DNA提取试剂盒为天根生化科技有限公司生产的组织基因组DNA提取试剂盒。

实施例2：

本实施例涉及的特异性引物检测鼠源性成分的方法的工艺过程分为特异性引物合成、DNA提取、反应体系建立、PCR扩增、鼠源性成分分析结果评价五个步骤：

(1)、特异性引物设计合成：根据Genbank中鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成特异性引物，特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’；

(2)、DNA提取：取鼠肌肉组织(与实施例1的鼠源不同)1g研磨成糜状，然后按照组织基因组DNA提取试剂盒使用说明操作，提取DNA，经核酸蛋白分析仪测定提取的DNA的浓度为220ng/μL，纯度为1.85，用RNase/DNase-free H₂O将提取的DNA浓度稀释为5ng/μL，备用；

(3)、反应体系建立：以步骤(2)提取的DNA为模板，用特异性引物建立10μL的PCR反应体系，取体积为2μL和浓度为5ng/μL的DNA模板、体积为1μL和浓度为5μM的上游引物F、体积为1μL和浓度为5μM的下游引物R以及体积为5μL的2×Master mixture，剩余部分用RNase/DNase-free H₂O补足，实现反应体系的建立；同时，设置三组平行实验；

(4)、PCR扩增：将步骤(3)建立的反应体系置于实时荧光定量PCR仪上，设置以下条件：①、模板变性：95℃-5min；②、QPCR扩增：95℃-20s，60℃-10s，72℃-10s，40个循环，在72℃时采集荧光信号；③、熔解曲线：95℃-5s，65℃to 97℃的速率为0.5℃/5s，1个循环。

(5)、鼠源性成分分析结果评价：经测定得到三组平行实验的Cp值分别为16.33、16.94和16.28，经加权平均计算得到Cp值为16.52，Cp值的标准差为0.366，熔解曲线如图2所示，有明显的单一主峰，且重合度良好，表明利用该引物能够检测到鼠源性成分，且特异性好。

本实施例涉及的特异性引物根据Genbank中鼠的线粒体细胞色素b基因序列设计并合成的，特异性引物的上游引物F的碱基序列为5’-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3’，特异性引物的下游引物R的碱基序列为5’-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3’。

上游引物F：GCCTTATAATTAATTGGAGGTA

下游引物R：AGCTATATTATGTGCTTGAT