一种引发溶血性输血反应的ABO血型变异型的SNP位点的制作方法

本发明属于基因诊断制品技术领域，具体涉及一种用于检测ABO血型系统中A型变异型血型基因引发的急性或者迟发性溶血性输血反应的SNP位点。

背景技术：

正常的ABO血型分为A型、B型、AB型与O型四种血型，但是在ABO血型基因发生变异的情况下如SNP、缺失、插入、重复等，造成ABO血型红细胞表面抗原与血浆中的抗体发生变化，例如本发明中发现的这例ABO血型系统中A型变异型血型基因，红细胞上A抗原比正常A型人要弱，但是血浆中存在抗-A1细胞的抗体，一旦输注A型人血液，极易发生输血性溶血反应。

溶血性输血反应(Hemolytic Transfusion Reaction；HTR)分为急性与迟发性溶血性输血反应，ABO系统不相合的输血一般为急性溶血性输血反应，危害极大。一般在输血后24h内发生，多于输血后立即发生，是最严重的输血副反应，一旦发生需立即抢救，否则致死率很高。只要输入5～10ml ABO不相容血液即可出现明显症状；输血量超过200ml，将会造成严重后果。临床上常表现为血管内溶血，患者有发热、寒战、恶心、背痛，随后出现血红蛋白尿，血红蛋白血症，低血压休克，均应考虑为急性血管内溶血性输血反应，应迅速停止输血并进行各项检查。同时这一过程会引起补体激活，启动凝血系统，释放缓激肽和儿茶酚胺，诱发DIC；甚至发生循环与肾功能衰竭；因此通常把低血压休克、DIC、急性肾衰竭称为急性血管内溶血三联症。

无论是在国内或是国外，ABO血型的错误输注是引起急性溶血性输血反应最为常见的因素，根据美国FDA报告，急性溶血反应死亡159例中139例是ABO血型不合的输血所致。其次比较常见的是A变异型，患者因免疫性因素(输血、妊娠或流产)产生抗A1抗体，如果再次输入A型血液就造成急性或迟发性免疫性溶血反应。2012年Transfusion报道了一例A型变异型的患者错误输注A型血液，患者发生急性输血性溶血反应而造成死亡，针对此种情况，必须强调预防的重要性。

技术实现要素：

本发明的目的是提供一种ABO血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的SNP位点，从而弥补现有技术的不足。

申请人对一个呈常染色体9q34.1-9q34.2显性遗传的A型变异型血型基因的家系成员进行了测序，找到了该家系成员A型变异型基因存在遗传上的致病突变，造成了A抗原数量和质量的改变，并且通过免疫刺激产生抗-A1抗体，一旦发生错误血型的输注(输注A型血)，很有可能发生致命的危害。为了避免其通过输血造成急性溶血性输血反应，从而促成了本项发明。

本发明提供一种用于检测ABO血型系统A型变异型血型基因引发的急性溶血性输血反应的SNP位点，为ABO血型基因编码区域由起始密码子起的第692位碱基，为C＞A的突变；

本发明还提供上述SNP位点的用途，是用于制备检测急性或者迟发性溶血性输血反应的制品；

所述的制品，为检测ABO血型系统A型变异型血型变异的制品；

所述的制品，优选为分子检测试剂盒；

本发明再一个方面提供一种检测ABO血型系统A型变异型血型变异的制品；所述的制品至少包含有检测上述SNP位点的分子标记；

作为实施例的优选，所述的分子标记为PCR扩增用的引物对或检测探针；

其中用于检测上述SNP位点的直接扩增及测序引物信息如下：

ABO-E7F:5'-CCCCGTCCGCCTGCCTTGCAG-3' SEQ ID NO:1

ABO-E7R:5'-GGGCCTAGGCTTCAGTTACTC-3' SEQ ID NO:2

用于检测上述SNP位点单倍型测序引物信息如下：

ABO-E7W-F：5'-CTGCTGCTCTAAGCCTTCCAA-3' SEQ ID NO:3

ABO-E7W-R：5'-TTACTCACAACAGGACGGACAAA-3' SEQ ID NO:4。

本发明提供了ABO血型A型变异型基因检测的新用途，从而提供了一种有效的避免急性溶血性输血反应发生的基因诊断、产前基因筛查及遗传咨询的途径，应用效果表明本发明所提供的基因的SNP位点及检测引物可以有效的用于临床患者外周血进行ABO血型A型变异型基因突变位点的快速检测。

附图说明

图1：ABO血型A型变异型基因先证者基因突变位点测序图，正常A型参考序列，参比序列来源于BGMUT(国际血型基因突变库)；

图2：先证者直接测序图；

图3：先证者克隆测序图，先证者ABO基因编码区域由起始密码子起第692位碱基发生了突变(nt692C＞A)。

具体实施方式

申请人在一个ABO血型A型变异型基因家系中发现致病性SNP位点，并证实该基因的突变是导致A型血型发生变异导致红细胞A抗原比正常A型人红细胞A抗原要弱，并且血浆中产生同种抗-A1抗体。一旦输入A型血液，很可能引发急性溶血性输血反应，为了做到及时检测和预防，从而促成了本发明。

A变异型位于染色体9q34.1-9q34.2，可转录成大约1065bp的mRNA(NCBI登录号为NM_020469.2)，直接翻译形成355个氨基酸组成的蛋白质。

下面结合实施例对本发明进行详细的描述。

实施例1：从ABO血型A型变异型基因先证者基因检测确认A型变异型的突变位点。

1、提取外周血基因组DNA：

在符合国家相关政策规定，并在取样对象同意的基础上，抽取ABO血型A型变异型基因家系成员外周静脉血2-5ml，放入EDTA-Na₂抗凝管内，-80℃冻存备用；DNA提取使用LIFE公司的DNA提取试剂盒，具体操作流程如下：

冻存的EDTA抗凝血在室温融化后，取500ul放于离心管，加入等体积的红细胞裂解液(pH8.0)，涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。重复加入红细胞裂解液500ul涡旋混匀5分钟，12000rpm离心5分钟，弃上清。

沉淀物涡旋混匀5分钟，加入核裂解液50ul，涡旋混匀5分钟，置于56℃金属浴15分钟。从水浴中取出样品，加入蛋白清除液135ul。涡旋充分混匀，至于4℃30分钟。

室温下12000rpm离心5分钟，吸取上清液(约200ul)至一新离心管中。加入冰乙醇500ul，反复震荡离心管，直至白色DNA沉淀物析出。室温12000rpm离心2分钟，弃上清。向DNA沉淀加入75％乙醇，漂洗一次，室温12000rpm离心3分钟，弃上清，置于室温中挥发剩余乙醇，最后加入50μLTE(pH8.0)，4℃过夜溶解DNA。

对提取的DNA行琼脂糖胶电泳，并应用紫外分光光度计在260nm和280nm比色，检测DNA纯度及浓度。

2、直接测序法寻找先证者A变异型基因的突变位点

PCR扩增目的片段：反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：95℃预变性10分钟；94℃60秒，63℃90秒，72℃60秒，10个循环；94℃60秒，61℃90秒，72℃60秒，25个循环；72℃延伸10min，扩增产物10℃保温。

(2)反应体系：(TAKARA Ex-Taq polymerase)

应用该反应体系进行先证者的基因组DNA模板与上述ABO-E7F、ABO-E7R引物的扩增反应。

PCR产物测序：应用常规Sanger测序法对上述PCR产物进行测序，其中应用引物对ABO-E7F:5'-ATCCGCCTGCCTTGCAGATA-3'；ABO-E7R:5'-AGCCTAGGCTTCAGTTACTCACAACA-3'在先证者发现ABO血型A基因编码区域由起始密码子起第692位碱基发生了突变，第692位碱基出现AC杂合序列。多次测序结果表明该突变位点的确存在该突变，并不是因为扩增或测序错误引进的(图2)。

实施例2SNP位点的验证

3、对ABO基因第7外显子进行单倍型测序，确定先证者A变异型基因的突变位点

PCR扩增目的片段引物：ABO-E7F:5'-ATCCGCCTGCCTTGCAGATA-3'；ABO-E7R:5'-AGCCTAGGCTTCAGTTACTCACAACA-3'。

PCR扩增引物也可以选用其它能扩增上述SNP位点的引物对。

PCR扩增目的片段的反应条件与反应体系：

(1)PCR反应条件：95℃预变性5分钟；95℃30秒，60℃30秒，72℃50秒，40个循环；72℃延伸5min，扩增产物10℃保温。

(2)反应体系：(TAKARA LA-Taq polymerase)

应用该反应体系分别进行每名家系成员的基因组DNA模板与发明者设计的克隆测序的引物进行扩增反应。将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用ABO-E7W-F：5'-CTGCTGCTCTAAGCCTTCCAA-3'；ABO-E7W-R：5'-TTACTCACAACAGGACGGACAAA-3'(测序引物也可以选用从A型变异基因上设计的，能扩增SNP位点的其它引物)确定样本的单倍型序列(图3)。该突变为一新发现的突变。该突变不存在于下面的三个数据库中：单核苷酸多态性数据库(ftp://ftp.ncbi.nih.gov/snp/database/)，血型基因突变库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gv/mhc/xslcgi.fcgi？cmd＝b gmut/systems_info&system＝abo)，表明该突变非常罕见，该突变导致了编码A血型的蛋白组成的核苷酸发生改变，A基因编码区域由起始密码子起第692位碱基由C＞A，导致了第231位氨基酸由苏氨酸变为天冬氨酸；氨基酸的突变从而引起了此A变异型的个体A抗原表位发生缺失抗原减弱，导致这种个体不需要免疫刺激就能够产生血浆中能够产生同种的抗-A1抗体(天然免疫)，当输注正常人的A型血液时就会发生急性溶血性输血反应，从而危及患者生命。而在近430余例正常当地人群的外周血基因组DNA样本中进行该位点的突变筛查，未发现该突变。

在青岛市中心血站输血医学研究所收集的先证者家系成员，提取他们的外周血基因组DNA，应用上述DNA作为模板与ABO-E7F、ABO-E7R引物进行PCR目的片段的扩增，常规Sanger测序法应用上述这对引物对PCR产物进行直接测序，发现该先证者的两名家系成员的ABO血型A基因存在本发明中发现的SNP突变，即编码区域由起始密码子起第692位碱基发生了AC杂合突变。继续对发现SNP突变的两位家系成员进行ABO基因第6,7外显子及第6内含子的单倍型测序，应用上述提取的一名家系成员(先证者父亲)的基因组DNA作为模板与ABO-E6mo、ABO-E7mo引物进行PCR目的片段的扩增，将PCR产物克隆入T载体，挑取多个菌落进行单倍型序列测定，单倍型测序引物使用上述引物，确定样本的单倍型序列。单倍型测序发现，两位家系成员A基因编码区域第692位碱基由C＞A，导致了第231位氨基酸由苏氨酸变为天冬氨酸，与先证者完全一致，而且这一名家系个体血浆中都存在同种抗-A1抗体。

通过上述的分析，证明发明者设计的引物可以用来检测个体ABO血型基因是否发生A基因突变，从而有潜在的发生输血后急性输血型溶血反应的危险。

SEQUENCE LISTING

<110> 青岛市中心血站

<120> 一种引发溶血性输血反应的ABO血型变异型的SNP位点

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 1

<400> 1

ccccgtccgc ctgccttgca g 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 2

<400> 2

gggcctaggc ttcagttact c 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 3

<400> 3

ctgctgctct aagccttcca a 21

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 4

<400> 4

ttactcacaa caggacggac aaa 23