实时荧光PCR特异性检测远志的引物及检测方法与流程

本发明属于生物
技术领域：
，特别涉及一种特异性好、灵敏度高的实时荧光PCR特异性检测远志的引物及检测方法。
背景技术：
：中药鉴定的主要内容为中药材及其基元的鉴定，也包括饮片、提取物和中成药的中药成分鉴定，中药的准确鉴定是中药事业运行和发展的基本环节。以往对于中药的检测是根据形态和显微镜下特征进行分类与鉴定，鉴定周期长、时效性差。随着各种先进仪器以及分子生物学的发展，新的鉴别方法亦纷纷推出，如光谱鉴别、色谱鉴别、实时荧光PCR及DNA分子标记鉴别和蛋白质检测等等。实时荧光PCR检测是将传统PCR检测模式中的PCR扩增和检测相结合（即在同一个密闭容器中将PCR扩增反应与荧光染料检测结合在一起），即在每一个PCR循环后检测扩增产物，当PCR扩增反应结束后，可以得到每个样品的PCR扩增产物变化曲线。通过分析这些反应曲线，可以得出待测物的定性、定量检测结果，不仅具有普通PCR的高灵敏性，还具有高特异性和高精确性。然而，对于实时荧光PCR检测其PCR扩增引物及具体检测方法尤为重要，不同的引物及检测方法所得到的检测结果截然不同。迄今为止，还没有关于特异性好、灵敏度高的实时荧光PCR特异性检测远志的引物及检测方法的相关报道。技术实现要素：：本发明是为了解决现有技术所存在的上述技术问题，提供一种特异性好、灵敏度高的实时荧光PCR特异性检测远志的引物及检测方法。本发明的技术解决方案是：一种实时荧光PCR特异性检测远志的引物，其特征在于所述引物的DNA序列如下：上游引物：5’-AATGCGATACTTGGTGTGAATTG-3’；下游引物：5’-CAAGAGATGAGGCGAAGGC-3’。一种上述实时荧光PCR特异性检测远志的引物的检测方法，其特征在于：反应体系为：2X浓度的SYBR®PremixExTaq12.5μL浓度为10μmol/L的上游引物0.25μL浓度为10μmol/L的下游引物0.25μL浓度<50ng的待检样品的DNA模板1μL双蒸水11μL；反应参数为：变性，95℃，30s；扩增，95℃，5s、60℃，30s；循环次数30；30个循环以下产生特异性扩增曲线即为远志。本发明PCR引物设计合理，用于实时荧光PCR检测，可以检测出来自远志的微量DNA，完全将远志与其它中药材的ITS2基因进行区分，检测特异性好、灵敏度高，方法快速，易操作。附图说明图1为本发明实施例的引物PCR扩增电泳检测结果图。图2为本发明实施例实时荧光PCR特异性检测结果图。图3为本发明实施例实时荧光PCR的溶解曲线检测结果图。图4为本发明实施例实时荧光PCR特异性检测远志与其它中草药的结果图。图5为本发明实施例灵敏度分析结果图。具体实施方式一.实时荧光PCR特异性检测远志引物序列的设计1.远志相近物种ITS2序列分析登录NCBI（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/），以Polygalatenuifolia及ITS2为关键词在nr数据库中进行搜索，将搜索结果的序列下载存盘后，进行BlastN程序在nr数据库中进行相似性序列的搜索，并将所有相似性序列下载存盘。2.远志物种特异性检测引物的设计将下载的序列进行序列的相似性分析和序列性分析，在序列的差异处设计特异性引物：上游引物：5’-AATGCGATACTTGGTGTGAATTG-3’；下游引物：5’-CAAGAGATGAGGCGAAGGC-3’；二.远志ITS2序列的克隆及测序验证1.远志物种特异性检测引物合成在上海生工生物工程有限公司合成远志物种特异性检测引物1对，其DNA序列为：上游引物：5’-AATGCGATACTTGGTGTGAATTG-3’；下游引物：5’-CAAGAGATGAGGCGAAGGC-3’；2.远志DNA的提取采用DNA提取试剂盒（购于宝生物公司）提取远志（安国市药源中药材有限公司商品，产地四川）模板DNA，用微量分光光度计检测提取远志模板DNA的浓度为100ng左右；琼脂糖凝胶电泳检测：以合成的特异性引物PCR扩增远志模板DNA的后，以2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，结果如图1所示。图1中：M.DL2000marker；1~5.引物扩增结果；6.水对照。表明经琼脂糖凝胶电泳检测后，分别产生143bp的特异性电泳条带，电泳效果最好，PCR扩增效率高。片段的切胶回收：采用宝生物公司的DNA片段回收试剂盒将目的条带回收及纯化，操作过程按试剂盒附带的说明书进行。回收片段的连接、克隆及测序：回收片段与克隆载体pMD-19T连接，转化，经菌液PCR检测，阳性菌株送上海生物工程有限公司进行序列测定，测序结果采用NCBI的BlastN程序通过序列比对。比对结果确定所克隆的目的片段的序列为远志ITS2序列。三.实时荧光PCR特异性检测远志的方法25μL反应体系为：2X浓度的SYBR®PremixExTaq12.5μL浓度为10μmol/L的上游引物（SEQIDNO.1）0.25μL浓度为10μmol/L的下游引物（SEQIDNO.2）0.25μL浓度<50ng的待检样品的DNA模板1μL双蒸水11μL反应参数为：变性，95℃，30s；扩增，95℃，5s、60℃，30s；循环次数30；30个循环以下产生特异性扩增曲线即为远志。本发明实施例与水对照、空白对照的特异性扩增曲线检测结果如图2所示。图2中：1.远志、2.水对照、3.空白对照。将本发明实施例与水对照、空白对照的溶解曲线检测结果如图3所示。图3中：1.远志、2.水对照、3.空白对照。结果证明了本发明所设计引物进行PCR扩增具有有效性及特异性。四.本发明实施例检测方法的特异性检测：采用DNA提取试剂盒提取下表所示各待测样品的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA的浓度为50ng，除模板DNA外，其它按照本发明实施例所述实时荧光PCR特异性检测远志的方法实时荧光PCR特异性检测栀子等其它中药材，结果如图4所示。图4中图中：1、2、3分别代表ZY1、ZY2、ZY3，4代表ZY4-ZY30的扩增曲线，5为及水对照，6为空白对照。样品编号样品名称来源/产地ZY1远志安国市药源中药材有限公司·四川ZY2远志安国市药源中药材有限公司·甘肃ZY3甘草进口ZY4栀子毫州市大西北药业有限责任公司·安徽省毫州市ZY5龙胆草安国市药源中药材有限公司·吉林ZY6知母安国市药源中药材有限公司·河北ZY7黄芩安国市药源中药材有限公司·河北ZY8黄连安国市药源中药材有限公司·四川ZY9肉苁蓉徐州医药股份有限公司中药饮片厂ZY10肉苁蓉石家庄市诚信中药材有限公司ZY11管花肉苁蓉山东嘉泰中药饮片有限公司ZY12肉苁蓉毫州市永刚饮片厂有限公司ZY13仙茅安国市药源中药材有限公司·广西ZY14锁阳安国市药源中药材有限公司·内蒙古ZY15枸杞子宁夏中宁县枸杞开发有限公司ZY16菟丝子安国市药源中药材有限公司·内蒙古ZY17地黄安国市药源中药材有限公司·河南ZY18黄柏安国市ZY19黄柏吉林省北药药材加工有限公司ZY20关黄柏黑龙江ZY21缬草毫州市永刚饮片厂有限公司ZY22金银花安国市药源中药材有限公司·广西ZY23枇杷安国市药源中药材有限公司·内蒙古ZY24桔梗宁夏中宁县枸杞开发有限公司ZY25铁皮石斛杭州然电子商务有限公司·云南ZY26石斛广州ZY27草决明北京同仁堂饮片有限责任公司·安徽ZY28天花粉安国市药源中药材有限公司·河南ZY29麦冬安国市药源中药材有限公司·四川ZY30百合安国市药源中药材有限公司·甘肃结果表明：产生的30个循环以下的特异性扩增曲线即为远志，其他样品在30个循环以后出现扩增曲线或没有扩增曲线，说明本发明的检测方法可以准确的对远志的成分进行鉴定，具有很好的特异性。五.本发明实施例检测方法的灵敏度检测采用DNA提取试剂盒提取远志样品（安国市药源中药材有限公司·四川）的模板DNA，用微量分光光度计分别检测所提取的模板DNA梯度稀释，制备成25ng/μL、5ng/μL、1ng/μL、0.2ng/μL、0.04ng/μL5个浓度梯度样品，分别按照上述反应体系及反应参数进行实时荧光PCR扩增，以确定本标准方法的检测灵敏度，结果如图5所示。图5中：1、25ng/μL扩增结果；2、5ng/μL扩增结果；3、1ng/μL扩增结果；4、0.2ng/μL扩增结果；5、0.04ng/μL扩增结果；6、空白对照。结果表明：所产生特异性扩增曲线即为远志，当DNA浓度≥0.04ng/μL时均可以特异扩增，即该标准方法的检测灵敏度为0.04ng/μL。说明本发明实施例检测方法可以准确的对远志的成分进行鉴定，具有很好的灵敏度。序列表<110>辽宁师范大学<120>实时荧光PCR特异性检测远志的引物及检测方法<130>2016<160>2<170>PatentInversion3.3<210>1<211>24<212>DNA<213>上游引物<400>1aatgcgatacttggtgtgaattg23<210>2<211>19<212>DNA<213>下游引物<400>2caagagatgaggcgaaggc19当前第1页1 2 3