本发明涉及分子遗传学领域，涉及一种梨PpAIV2基因位点的分子标记，尤其涉及梨PpAIV2基因位点的分子标记的筛选方法。
背景技术：
梨是我国重要的果树，属于多年生木本植物，童期较长。果实糖度是最重要的品质性状之一，高糖、糖度适中是优质商品梨的重要指标。果实糖度属于果实性状，传统杂交育种选育方法周期长、难度大。一般需要3～5年结果后才能开展初步鉴定。通过定位果实糖度性状重要基因位点来辅助育种可以有效解决这一问题。
遗传研究表明，蔗糖是梨果实主要糖份之一，蔗糖含量受主效基因位点控制，不同的材料其控制果实蔗糖含量性状的基因位点可能会存在差异。砂梨的成熟果实中，蔗糖含量与PpAIV2位点呈连锁关系。
在砀山‘酥梨’参考基因组中，距离PpAIV2(Pbr030762.1)终止密码子下游552bp处存在1个(AAG)5简单重复序列，在该重复序列两段设计位点特异引物，正向：GTTGTCACGAAGGAGAAGG；方向：CCGATGCTGGGAGAAGAT，预测PCR产物长度221bp。用该引物分别对梨不同品种基因组DNA进行扩增，这些梨品种包括‘杭青’、‘珍珠梨’、‘早酥’、‘秋水’、‘红早酥’、‘二宫白’、‘新雅’、‘喜水’、‘吾妻锦’、‘初夏绿’、‘雪青’、‘义乌三花梨’、‘早熟黄皮’、‘D2’、‘幸水’、‘丰水’、‘新绿水’、‘翠冠’、‘六月酥’、‘西子绿’、‘早绿’、‘蜜雪’、‘丰香’、‘粗花雪梨’、‘长二十世纪’、‘南水’、‘良月’、‘秋荣’、‘库尔勒香梨’、‘八月红’、‘真香’、‘大果清香’、‘玉冠’、‘翠玉’、‘清香’、‘圆黄’、‘日光’、‘美人酥’、‘红太阳’、‘苹果梨’、‘中梨4号’、‘大鸭梨’、‘龙泉酥’、‘博多青’、‘苏翠1号’、‘莱阳梨’、‘金秋’、‘若光’、‘夏露’、‘脆绿’、‘义乌霉梨’，共53个。在目标带附近共检测出7个等位变异。这些等位变异在物理距离上位于PpAIV2位点处，在F1群体中满足1：1独立自由分配，是PpAIV2紧密连锁的分子标记。
技术实现要素：
本发明针对现有的不足，公开了一种梨PpAIV2基因位点的分子标记，还公开该种梨PpAIV2基因位点的分子标记的筛选方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。
梨PpAIV2基因位点的分子标记，基因位点位于梨6号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp1097引物，其序列为：
左端引物序列GTTGTCACGAAGGAGAAGG，
右端引物序列CCGATGCTGGGAGAAGAT。
扩增梨基因组DNA，在221bp附近获得的扩增片段，即为梨PpAIV2基因位点的分子标记，该基因位点位于梨6号染色体，利用PCR对PpAIV2等位基因材料间杂交得到的F1代进行检测，单株准确率接近100％。
作为优选，标记位点为P.zaas-1。标记位点P.zaas-1为：对梨可溶酸转化酶基因PpAIV2毗邻的基因组序列简单序列重复(SSR)位点进行预测并设计位点特异引物，通过不同遗传背景种质及F1代群体基因组中的扩增，获得1个与PpAIV2紧密连锁的SSR等位变异位点。
梨PpAIV2基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，
A.以梨PpAIV2等位变异品种为亲本进行杂交，得到杂种F1；利用基因组重测序数据获得PpAIV2在不同品种梨遗传材料中的等位变异；
B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，参考亲本重测序结果，采用PpAIV2旁侧简单序列重复的标记SSR对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.06g/ml～0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；
C.根据每个分子标记的群体基因型资料分析其遗传分离规律，通过卡方分析计算各标记的遗传分离符合度；选取距PpAIV2物理距离最近且遗传分离与PpAIV2等位变异遗传分离相符的SSR标记作为PpAIV2的等位变异标记；
D.根据分子标记与PpAIV2之间的物理距离，以及该标记的群体基因型资料，符合PpAIV2等位变异分离规律，卡方测验的P<0.01且距PpAIV2物理距离最近的分子标记，即为PpAIV2基因位点分子标记。
PpAIV2基因位点的位置由分子标记的染色体位置确定：在‘杭青’、‘珍珠梨’、‘早酥’、‘秋水’、‘红早酥’、‘二宫白’和‘雪青’等梨品种中发现P.zaas-1处存在多个等位变异，P.zaas-1在以PpAIV2等位变异材料为亲本的F1中与PpAIV2等位变异相关的概率P<0.01，P.zaas-1与梨PpAIV2基因位点的物理位置紧密相连，P.zaas-1位点的Zaasp1097标记即为获得的梨PpAIV2基因位点的分子标记。
作为优选，步骤C中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。
作为优选，步骤D中，标记1：1遗传分离符合度的卡方值，满足P小于0.01。
作为优选，步骤C中，用软件Excel，最大P值设为0.01，筛选SSR位点。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明提供梨PpAIV2基因位点的分子标记，通过检测与PpAIV2基因位点连锁的分子标记，潜在应用在于可以预测梨果实成熟期蔗糖含量，加快梨果实蔗糖含量性状的选择进度。
(2)通过本发明分子标记在国际上首次开发获得了梨PpAIV2基因等位变异的SSR标记，它可获得100％的梨PpAIV2基因等位变异检出率。梨为自交不亲和树种，树体为F1杂种，基因组高度杂合，对梨PpAIV2基因等位变异的的精确检测工作居于同领域前列。
(3)通过本发明分子标记检测的基因位点变异明确，鉴定方便。通过检测与PpAIV2基因位点连锁的分子标记，潜在应用可以预测梨植株的果实蔗糖含量性状，用于砂梨品种或品系的基因型检测，以判断该品种或品系是否具有果实高蔗糖/低蔗糖含量性状，进而快速筛选目标果实蔗糖含量品种或品系用于梨育种。分子标记技术检测方便快速，不受环境影响。
(4)辅助育种选择目标明确，节约成本。在传统育种方法中，首先要等到植株度过童期，结果后才可进行果实蔗糖含量性状调查，不仅周期很长，也占用了土地资源。因此传统育种不仅费时，而且成本高。通过检测果实蔗糖含量性状基因位点，可以在苗期就鉴定出果实高蔗糖含量或低蔗糖性状的单株，进行早代筛查，不仅节约生产成本而且大大提高梨果实蔗糖含量性状的选择效率。
具体实施方式
实施例1
梨PpAIV2基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，
A.以梨PpAIV2等位变异品种为亲本进行杂交，得到杂种F1；
B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，参考亲本重测序结果，采用PpAIV2旁侧简单序列重复的标记SSR对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.06g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；
C.根据每个分子标记的群体基因型资料分析其遗传分离规律，通过卡方分析计算各标记的遗传分离符合度；选取距PpAIV2物理距离最近且遗传分离与PpAIV2等位变异遗传分离相符的SSR标记作为PpAIV2的等位变异标记；
D.根据分子标记与PpAIV2之间的物理距离，以及该标记的群体基因型资料，符合PpAIV2等位变异分离规律，卡方测验的P<0.01且距PpAIV2物理距离最近的分子标记，即为PpAIV2基因位点分子标记。
步骤C中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。
步骤D中，标记1：1遗传分离符合度的卡方值，满足P小于0.01。
实施例2
梨PpAIV2基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，
A.以梨PpAIV2等位变异品种为亲本进行杂交，得到杂种F1；
B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，参考亲本重测序结果，采用PpAIV2旁侧简单序列重复的标记SSR对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；
C.根据每个分子标记的群体基因型资料分析其遗传分离规律，通过卡方分析计算各标记的遗传分离符合度；选取距PpAIV2物理距离最近且遗传分离与PpAIV2等位变异遗传分离相符的SSR标记作为PpAIV2的等位变异标记；
D.根据分子标记与PpAIV2之间的物理距离，以及该标记的群体基因型资料，符合PpAIV2等位变异分离规律，卡方测验的P<0.01且距PpAIV2物理距离最近的分子标记，即为PpAIV2基因位点分子标记。
实施例3
梨PpAIV2基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，
A.以梨PpAIV2等位变异品种为亲本进行杂交，得到杂种F1；
B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，参考亲本重测序结果，采用PpAIV2旁侧简单序列重复的标记SSR对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.07g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；
C.根据每个分子标记的群体基因型资料分析其遗传分离规律，通过卡方分析计算各标记的遗传分离符合度；选取距PpAIV2物理距离最近且遗传分离与PpAIV2等位变异遗传分离相符的SSR标记作为PpAIV2的等位变异标记；
D.根据分子标记与PpAIV2之间的物理距离，以及该标记的群体基因型资料，符合PpAIV2等位变异分离规律，卡方测验的P<0.01且距PpAIV2物理距离最近的分子标记，即为PpAIV2基因位点分子标记。
实施例4
梨PpAIV2基因位点的分子标记的筛选方法，，包括以下方法，
A.以PpAIV2基因等位变异材料为亲本进行杂交，得到杂种F1；
B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，借助梨参考基因组和亲本重测序结果，在梨PpAIV2基因附近寻找简单序列重复(SSR)位点并开发SSR引物，采用SSR引物对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；
C.根据遗传分离比结合卡方测验，分析各SSR位点的遗传分离规律；
D.根据每个分子标记的群体基因型资料，参照其与PpAIV2物理距离，通过分析其与PpAIV2等位基因相关的概率P值确定分子标记，P<0.01的分子标记，即为PpAIV2基因位点分子标记。
步骤B中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。
步骤C中，卡方测验用软件Excel，P值为0.01。
步骤D中，根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应PpAIV2基因物理距离，分析测得与PpAIV2等位变异相关的概率P值，P<0.01的分子标记，即为PpAIV2基因位点分子标记。发现Zaasp1097(P＝0)标记与梨PpAIV2基因位置紧密相连，Zaasp1097标记即为获得的梨PpAIV2基因位点的分子标记。
实施例5
梨PpAIV2基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，
A.以梨PpAIV2基因等位变异材料为亲本进行杂交，得到杂种F1；
B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，借助梨参考基因组和亲本重测序结果，在PpAIV2基因附近寻找简单序列重复(SSR)位点并开发SSR引物，采用SSR引物对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；
C.根据遗传分离比结合卡方测验，分析各SSR位点的遗传分离规律；
D.根据每个分子标记的群体基因型资料，参照其与PpAIV2物理距离，通过分析其与PpAIV2等位基因相关的概率P值确定分子标记，P<0.01的分子标记，即为PpAIV2基因位点分子标记。
步骤B中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。
实施例6
梨PpAIV2基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，
A.以梨PpAIV2等位变异材料为亲本进行杂交，得到杂种F1；
B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，借助梨参考基因组和亲本重测序结果，在PpAIV2基因附近寻找简单序列重复(SSR)位点并开发SSR引物，采用SSR引物对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；
C.根据遗传分离比结合卡方测验，分析各SSR位点的遗传分离规律；
D.根据每个分子标记的群体基因型资料，参照其与PpAIV2物理距离，通过分析其与PpAIV2等位基因相关的概率P值确定分子标记，P<0.01的分子标记，即为PpAIV2基因位点分子标记。
步骤B中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。
步骤C中，卡方测验用软件Excel，P值为0.01。
实施例7
梨PpAIV2基因位点的分子标记的筛选方法，包括以下方法，
A.以梨PpAIV2等位变异材料为亲本进行杂交，得到杂种F1；
B.用CTAB法提取F1群体各单株的DNA，借助梨参考基因组和亲本重测序结果，在PpAIV2基因附近寻找简单序列重复(SSR)位点并开发SSR引物，采用SSR引物对两亲本进行多态性引物筛选，通过聚合酶链式反应进行扩增，扩增产物在密度为0.08g/ml的聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离分析，根据分子标记筛选结果，筛选出亲本间有多态的引物，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，聚合酶链式反应扩增程序同上，获取群体基因型资料；
C.根据遗传分离比结合卡方测验，分析各SSR位点的遗传分离规律；
D.根据每个分子标记的群体基因型资料，参照其与PpAIV2物理距离，通过分析其与PpAIV2等位基因相关的概率P值确定分子标记，P<0.01的分子标记，即为PpAIV2基因位点分子标记。
步骤B中，聚合酶链式反应在扩增仪上进行。
步骤C中，用软件Mapmaker 2.0，最小LOD值设为3，获得连锁图。
步骤D中，根据每个分子标记的群体基因型资料和与其对应PpAIV2基因物理距离，分析测得与PpAIV2等位变异相关的概率P值，P<0.01的分子标记，即为分子标记。发现Zaasp1097(P＝0)标记与梨PpAIV2基因位置紧密相连，Zaasp1097标记即为获得的梨PpAIV2基因位点的分子标记。
实施例8
材料与方法：
(一)梨PpAIV2等位变异材料为亲本的群体的构建与表型鉴定：
(1)对梨品种‘库尔勒香梨’(母本)与梨品种‘翠冠’(父本)进行杂交获得F1单株200个。
(2)F1单株种植于浙江省农业科学院海宁基地，位于浙江省海宁市许村镇杨渡村。
(二)F1群体的分子标记分析
(1)用CTAB法提取F1群体各株系DNA；
(2)首先用PpAIV2基因位点附近的4对SSR引物对‘库尔勒香梨’和‘翠冠’的基因组DNA多态性进行初步分析。PCR反应体积为25微升，其中10×buffer2.5微升，25mM MgCl21.5微升，2.5mM dNTPs 2微升，Taq酶(5单位/微升)0.2微升，模板DNA 20纳克，加水至25微升。SSR反应体系为DNA 94℃预变性3min后，94℃变性1min，56℃退火1min，72℃延伸展1min，循环35次，最后72℃延伸7min。在PE 9600扩增仪上进行PCR扩增，扩增产物在8％非变性聚丙烯酰胺凝胶(100ml聚丙烯酰胺溶液中含7.6克丙烯酰胺和0.4克甲叉双丙烯酰胺)上进行电泳分离，然后在紫外透射仪上照相，记录结果，亲本间有多态的引物在F1群体中进行分析，获取群体基因型资料；
(3)根据遗传分离比，利用Excel软件卡方测验计算，分析各SSR位点的遗传分离规律；
(4)根据每个分子标记的群体基因型资料，参照其与PpAIV2物理距离，通过分析其与PpAIV2等位基因相关的概率P值确定分子标记。
(三)结果与分析：
分子标记筛选结果表明，有1对SSR引物在双亲间有差异。利用Data Excel软件对该分子标记的群体基因型资料，卡方分析测得该位点满足1：1的分离比例(P<0.01)，Zaasp1097标记位于PpAIV2基因终止密码子下游552bp处，物理距离紧密相连，即获得梨PpAIV2基因位点的分子标记。
通过上述分子标记鉴定基因位点来预测梨PpAIV2基因型，预计可迅速提高我国梨品种果实受PpAIV2基因调控性状的育种进程。
P：表示标记位点不满足1：1分离的概率，P<0.01表该标记在遗传群体中满足自由独立遗传。
实施例9
梨PpAIV2基因位点的分子标记，基因位点位于梨6号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp1097引物，其序列为：
左端引物序列GTTGTCACGAAGGAGAAGG，
右端引物序列CCGATGCTGGGAGAAGAT。
实施例10
梨PpAIV2基因位点的分子标记，基因位点位于梨6号染色体，与其紧密连锁的分子标记为Zaasp1097引物，其序列为：
左端引物序列GTTGTCACGAAGGAGAAGG，
右端引物序列CCGATGCTGGGAGAAGAT。
标记位点为P.zaas-1。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。