专利名称：高稳定性的具抗体结合能力的重组蛋白a及其生产的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域；更具体地，本发明涉及高稳定性的具抗体结合能力的重组蛋白A及其生产。
背景技术：
蛋白A (Protein Α)来源于金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus)，为其表面的一种膜蛋白。蛋白A具有与抗体特异性结合的能力，蛋白A亲和层析柱已成为生物技术领域应用广泛的纯化抗体的亲和柱，可从腹水，血清和细胞培养上清或细胞抽提物中分离和纯化多种哺乳动物不同亚型的抗体或包含抗体Fc片段的基因工程重组蛋白。蛋白A可以通过基因工程重组技术生产。但是，目前市场销售的蛋白A具有不稳定的缺陷，从而影响其使用。本领域还需要进一步优化蛋白A及其生产技术，以提高其稳定性以及抗原结合能力，进而提高其应用价值。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的高稳定性的具抗体结合能力的重组蛋白A及其生产方法。在本发明的第一方面，提供一种具抗体结合能力的重组蛋白A，其是(a) SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸(如1-10 个，较佳地1-5个，更佳地1-3个)且具有(a)限定的蛋白相同的功能的由(a)衍生的蛋白。在另一优选例中，所述的缺失或添加发生在蛋白的羧基端、氨基端或者二者兼有。在本发明的另一方面，提供一种多核苷酸，其选自下组(i)编码所述的具抗体结合能力的重组蛋白A的多核苷酸；或(ii)与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。在另一优选例中，该多核苷酸编码SEQ ID NO 2所示氨基酸序列的蛋白。在另一优选例中，该多核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。在本发明的另一方面，提供一种载体，它含有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种遗传工程化的宿主细胞，它含有所述的载体，或基因组中整合有所述的多核苷酸。在本发明的另一方面，提供一种生产所述的具抗体结合能力的重组蛋白A的方法，包括步骤(1)培养所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离所述的具抗体结合能力的重组蛋白A。在另一优选例中，在温度20士 10°C下培养所述的宿主细胞。在另一优选例中，在温度20士7°C下培养所述的宿主细胞；更佳地在温度20士5°C下培养所述的宿主细胞；更佳地在温度15士3°C下培养所述的宿主细胞。在另一优选例中，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞，培养所述宿主细胞过程中采用IPTG或乳糖诱导表达。在另一优选例中，采用0. 05-2. OmM浓度的IPTG诱导表达。在本发明的另一方面，提供所述的具抗体结合能力的重组蛋白A的用途，用于结合抗体；或用于制备抗体亲和柱；或用于抗体的纯化。在本发明的另一方面，提供一种纯化抗体的亲和柱，其包括亲和介质，以及附着于所述亲和介质的所述的具抗体结合能力的重组蛋白A。在另一优选例中，所述的亲和介质选自(但不限于)琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、纤维素、大孔吸附树脂等。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
图1、左图为金黄色葡萄球菌基因组抽提结果；右图为全长SPA(FL)与截短体 SPA (32-327) PCR产物的电泳鉴定结果。图中SPA-32指截短体SPA (32-327)。图2、菌落PCR鉴定结果。图3、将该重组表达载体转化入感受态的大肠杆菌BL21 (DE3)，并进行诱导表达。其中，Lanel诱导前；Lane2，3，4，5 :0. 5mM IPTG 诱导后。图4左图=SDS-PAGE检测在不同的温度条件下培养重组SPA(32-327)BL21 (DE3) 细胞，获得的培养上清和包涵体形式蛋白的表达情况。图4右图为SDS-PAGE检测在不同的诱导条件下培养重组BL21 (DE3)细胞中蛋白的表达情况。其中 Lane 1 诱导前；Lane 2 :0. ImM IPTG ；Lane 3 :0. 5mM IPTG ；Lane 4 1. OmM IPTG ；Lane 5 :10mM IPTG。Sup 上清；Pel 沉淀。图5、不同温度下SPA(32-327)的生长曲线图。图6、发酵进程曲线。图7、SDS-PAGE电泳鉴定DEAE-FF纯化蛋白。各泳道分别为1 =SPA(32-327)上清；2:流出液；3，4，5:目的蛋白。图 8、Ni-NTA 纯化 SPA (32-327)。图9、SPA(32-327)冻干前后的稳定性鉴定。其中各泳道分别为1 =SPA(32-327) 冻干前；2 :SPA (32-327)-His 冻干前；3 =SPA (32-327)冻干后；4 :SPA (32-327)-His 冻干后。图10、不同蛋白浓度的 SPA(32-327)或 SPA(32-327)-His 的 Dottern 实验结果。
具体实施例方式本发明人经过广泛而深入的研究，首次揭示一种高稳定性的具抗体结合能力的重组蛋白A，与野生型蛋白A相比，该重组蛋白A稳定性大大提高，具有更强的抗体结合能力。 在此基础上完成了本发明。如本文所用，除非另外说明，所述的“具抗体结合能力的重组蛋白A”、 "SPA(32-327) ”、“截短体蛋白SPA(32-327) ”、“截短体蛋白”等可互换使用，均是指相对于野生型蛋白A，其氨基端缺少31个氨基酸的蛋白；更佳地，相对于野生型蛋白A，其羧基端还缺少100-200个氨基酸(如173个氨基酸)。若需要表示野生型的蛋白，除非另外说明，其将被标示为“野生型蛋白A”、 "SPA(FL)全长蛋白”。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和蛋白是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或蛋白如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。“重组的”是指借助基因工程手段来获得(或大量制备)的蛋白、基因工程载体或细胞等。本发明的蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白、合成蛋白，优选重组蛋白。本发明的蛋白可以是天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如，细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主， 本发明的蛋白可以是糖基化的，或可以是非糖基化的。本发明的蛋白还可包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。本发明还包括所述具抗体结合能力的重组蛋白A的片段、衍生物和类似物。如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明的具抗体结合能力的重组蛋白A相同的生物学功能或活性的蛋白。本发明的蛋白片段、衍生物或类似物可以是(i) 有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的蛋白，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的蛋白，或(iii)成熟蛋白与另一个化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的蛋白，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此蛋白序列而形成的蛋白(如前导序列或分泌序列或用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列，或融合蛋白)。根据本文的定义这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。 然而，所述的具抗体结合能力的重组蛋白A及其片段、衍生物和类似物的氨基酸序列中，相对于野生型蛋白A，其氨基端缺少31个氨基酸的蛋白更佳地，相对于野生型蛋白A，其羧基端还缺少100-200个氨基酸(如173个氨基酸)。在本发明中，术语“具抗体结合能力的重组蛋白A”指具有本发明的具抗体结合能力的重组蛋白A活性的SEQ ID NO :2序列的蛋白。该术语还包括具有与所述具抗体结合能力的重组蛋白A相同功能的、SEQ ID NO :2序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)若干个(通常为1-20个，更佳地1-10个，还更佳如1-8个、1-5个、1-3个、或1_2 个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端添加或缺失一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括具抗体结合能力的重组蛋白A的活性片段和活性衍生物。最好的，在这些SEQ ID NO :2的变异形式中，相对于野生型蛋白A，其氨基端缺少31个氨基酸的蛋白；更佳地，相对于野生型蛋白A，其羧基端还缺少100-200个氨基酸(如173个氨基酸)。蛋白的变异形式包括同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与具抗体结合能力的重组蛋白A的DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用所述抗具抗体结合能力的重组蛋白A的抗血清获得的蛋白或蛋白。本发明还提供了其他蛋白，如包含具抗体结合能力的重组蛋白A或其片段的融合蛋白。发明还提供具抗体结合能力的重组蛋白A或蛋白的类似物。这些类似物与具抗体结合能力的重组蛋白A的差别可以是氨基酸序列上的差异，也可以是不影响序列的修饰形式上的差异，或者兼而有之。这些蛋白包括天然或诱导的遗传变异体。诱导变异体可以通过各种技术得到，如通过辐射或暴露于诱变剂而产生随机诱变，还可通过定点诱变法或其他已知分子生物学的技术。类似物还包括具有不同于天然L-氨基酸的残基(如D-氨基酸)的类似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、Y-氨基酸)的类似物。应理解，本发明的蛋白并不限于上述例举的代表性的蛋白。修饰(通常不改变一级结构)形式包括体内或体外的蛋白的化学衍生形式如乙酰化或羧基化。修饰还包括糖基化。修饰形式还包括具有磷酸化氨基酸残基(如磷酸酪氨酸，磷酸丝氨酸，磷酸苏氨酸)的序列。还包括被修饰从而提高了其抗蛋白水解性能或优化了溶解性能的蛋白。在本发明中，“具抗体结合能力的重组蛋白A保守性变异蛋白”指与SEQ IDNO 2 的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个(如 1个、2个或3个)氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成蛋白。这些保守性变异蛋白最好根据表1进行氨基酸替换而产生。表 权利要求
1.一种具抗体结合能力的重组蛋白A，其是(a)SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的蛋白；或(b)由(a)所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有(a)限定的蛋白相同的功能的由(a)衍生的蛋白。
2.一种多核苷酸，其选自下组(i)编码权利要求1所述的具抗体结合能力的重组蛋白A的多核苷酸；或( )与(i)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
3.如权利要求2所述的多核苷酸，其特征在于，该多核苷酸编码SEQID N0:2所示氨基酸序列的蛋白。
4.一种载体，其特征在于，它含有权利要求2或3任一所述的多核苷酸。
5.一种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求4所述的载体，或基因组中整合有权利要求2或3任一所述的多核苷酸。
6.一种生产权利要求1所述的具抗体结合能力的重组蛋白A的方法，其特征在于，包括步骤(1)培养权利要求5所述的宿主细胞，获得培养物；和(2)从培养物中分离权利要求1所述的具抗体结合能力的重组蛋白A。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，在温度20士10°C下培养权利要求5所述的宿主细胞。
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述的宿主细胞是大肠杆菌细胞，培养所述宿主细胞过程中采用IPTG或乳糖诱导表达。
9.权利要求1所述的具抗体结合能力的重组蛋白A的用途，用于结合抗体；或用于制备抗体亲和柱；或用于抗体的纯化。
10.一种纯化抗体的亲和柱，其包括亲和介质，以及附着于所述亲和介质的权利要求1 所述的具抗体结合能力的重组蛋白A。
全文摘要
本发明涉及高稳定性的具抗体结合能力的重组蛋白A及其生产。本发明还提供了包含所述的具抗体结合能力的重组蛋白A的亲和层析柱。本发明的具抗体结合能力的重组蛋白A与野生型蛋白A相比，稳定性大大提高，具有更强的抗体结合能力。
文档编号C12P21/02GK102558316SQ201010614100
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者冯矗, 李素霞, 赵致 申请人:上海雅心生物技术有限公司