专利名称：一种核酸扩增产物检测方法
技术领域：
本发明涉及一种实验检测方法，具体是指核酸扩增反应及其产物的检测方法。
背景技术：
生物遗传物质核酸可用作鉴定生物和诊断病原的靶分子，但试样品中的靶核酸分子量通常较少，需要对样品中的靶核酸分子进行扩增，亦核酸的体外合成反应，相关PCR技术、SDA技术和LAMP技术先后被发明和应用，这些技术扩增的效率较高，可把几个到几十个靶核酸分子高效扩增为巨量核酸分子产物，为各种病原微生物诊断和生物样本的核酸分子鉴定提供了技术基础。检测核酸扩增产物的方法有多种，有的需要昂贵的仪器，有的检测试剂对扩增反应有抑制作用，限制了这些方法的普及应用，如LAMP反应，鉴于其核酸合成的高效性，在实施过程中，其扩增反应需要在密闭的反应容器内进行，而其产物的检测，不能采用打开容器取样电泳鉴定扩增产物或加入染料的方法；因为若打开反应容器，易产生靶核酸产物分子气溶胶污染，导致后续检测实验出现无法消除的、持续的假阳性结果，一旦出现这种产物污染实验环境的情况，其污染在短期内极难消除，导致针对某一靶点的同一 LAMP检测实验在相当长时间内不能开展，是应用LAMP检测病原实验中最大的困扰，极大地限制了 LAMP技术的推广应用。虽然也有不打开容器而通过观察浊度的产生来判断检测核酸扩增反应的方法，但不同实验者目视条件下，对浊度产生与否得结果判断经常不一致，必需使用昂贵的仪器来保证其精密度，难以在基层普及开展。而如果在反应前即加入染料，其对核酸合成反应有干扰。因此开展此类实验，需要开发新的扩增产物检测方法。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供了简便、经济、灵敏且不需要打开反应容器的核酸扩增反应产物检测及污染控制方法。为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案一种核酸扩增产物检测方法，其特征在于包括如下步骤，(1)在核酸扩增反应前，于反应容器内，加入包裹有染料的固态微晶蜡，且保证微晶蜡不与反应液接触；(2)在核酸扩增反应时，维持扩增反应温度低于微晶蜡的熔点，且微晶蜡珠不与反应液接触；(3)扩增反应完成后，对反应容器加温至微晶蜡熔点，微晶蜡从固态转变成液态， 并浮于核酸反应液的上层；其中包裹的染料进入反应溶液中，与核酸扩增反应液均勻混合， 核酸扩增产物与染料结合，产生显色反应。进一步地，所述步骤C3)后，对反应液降温，浮在反应液上的液态微晶蜡凝固，并形成一道固体屏障，将反应溶液封闭在反应容器底部。本发明的检测方法科学合理、实用方便，一方面保证扩增反应的高效、无干扰，另外微晶蜡的加入确保反应过程中及完成后不打开反应容器，微晶蜡的熔解将染料放入溶液中，可完成产物染料法检测；而微晶蜡的降温凝固更是形成一层保护屏障；这都有效防止在操作中核酸扩增产物形成气溶胶污染。同时，加热熔解微晶蜡珠也是灭活反应中酶的步
马聚ο
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实施例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中图1-图3分别是本发明的实施例1的扩增反应前、灭活时、灭活后降温时的反应状态示意图；其中，图1的标记示意为1-锥形微量离心管，2-微晶蜡染料蜡珠，3-反应液。
具体实施例方式以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。实施例1一种核酸扩增及扩增产物检测方法是1，“微晶蜡荧光染料蜡珠”的制备，在柱状模具中加入适量熔解状态的液态微晶蜡，待凝固后加入定量的荧光染料溶液(通常为1000X SYBR Green I)，再加入适量液态微晶蜡；因荧光染料溶液和微晶蜡不互溶，所以待完全凝固后，形成包裹有液态荧光染料的 “微晶蜡荧光染料蜡珠”，从模具中取出即可使用。也可大量制备，置-20度贮存备用。2，图1所示，将核酸扩增反应所需的试剂按常规方法加入到锥形微量离心管中， 启动枋酸扩增反应前，将“微晶蜡荧光染料蜡珠”置入容器；由于尺寸适合，蜡珠将被留滞在锥形反应空间的上方，而反应液在底部，蜡珠在核酸扩增反应过程中不接触反应液，因此不会引入包括染料在内的，对核酸合成反应有干扰的物质。核酸扩增反应的要温度小于微晶蜡的熔点，因此染料也不会从蜡珠中泄露进入反应体系并干扰反应。反应所用的加温设备可以是PCR仪或带有温控功能的水浴锅；如果使带有热盖功能的PCR仪，核酸合成反应完成前，热盖温度不应超过微晶蜡的熔点。3，图2所示，扩增反应完成后，将反应管加热，温度达到微晶蜡的熔点后，微晶蜡从固态变成液态，由于其比重轻，浮于核酸反应溶液的上层，而其中包裹的液态染料溶液因密度大于液态微晶蜡，自动沉入核酸扩增反应溶液中；加热所产生的热能，可使染料溶液与核酸扩增反应溶液均勻混合，其中的核酸扩增产物与染料结合，并产生显色反应，这种显色反应通常还可以被一定波长的光激发产生更为明显的荧光。通常，加温过程也是核酸合成反应完成后的灭活核酸合成酶活性的步骤。4，图3所示，加热灭活完成后，可以利用PCR仪降低反应管的温度，或者自然降温， 当温度降低到微晶蜡的凝固点，浮在反应溶液上方的液态微晶蜡开始凝固，并迅速形成一道固体屏障，将反应溶液封闭在容器的底部，避了在后续操作中核酸扩增产物形成气溶胶污染。
5，结果判断，使用STOR GREEN I染料时，阳性反应呈绿色，即反应管中有大量靶核酸分子被染色，自然光下溶液为深浅不同的绿色。阴性反应为桔黄色，即STOR染料本身的颜色，同时其显色灵敏度可被增强，即使用紫外线或者特定波长的光照射激发荧光染料，使其发出耀眼的荧光，STOR GREEN I可以被紫外(310nm)和可见蓝光G97nm)激发后发绿光 (520nm)。最后应说明的是以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明， 尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。 凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
1.一种核酸扩增产物检测方法，其特征在于包括如下步骤，(1)在核酸扩增反应前，于反应容器内，加入包裹有染料的固态微晶蜡，且保证微晶蜡不与反应液接触；(2)在核酸扩增反应时，维持扩增反应温度低于微晶蜡的熔点，且微晶蜡珠不与反应液接触；(3)扩增反应完成后，对反应容器加温至微晶蜡熔点，微晶蜡从固态转变成液态，并浮于核酸反应液的上层；其中包裹的染料进入反应溶液中，与核酸扩增反应液均勻混合，核酸扩增产物与染料结合，产生显色反应。
2.根据权利要求1所述的核酸扩增产物检测方法，其特征在于所述步骤C3)后，对反应液降温，浮在反应液上的液态微晶蜡凝固，并形成一道固体屏障，将反应溶液封闭在反应容器底部。
全文摘要
一种核酸扩增产物检测方法，提供了一种不需要打开反应容器的核酸扩增反应产物检测及污染控制方法，包括如下步骤，(1)在核酸扩增反应前，于反应容器内，加入包裹有核酸染料的固态微晶蜡，且保证微晶蜡不与反应液接触；(2)在核酸扩增反应时，维持扩增反应温度低于微晶蜡的熔点，且微晶蜡珠不与反应液接触；(3)扩增反应完成后，对反应容器加温至微晶蜡熔点，微晶蜡从固态转变成液态，并浮于核酸反应液的上层；其中包裹的染料进入反应溶液中，与核酸扩增反应液均匀混合，核酸扩增产物与染料结合，产生显色反应。
文档编号C12Q1/68GK102559860SQ20101061418
公开日2012年7月11日 申请日期2010年12月30日 优先权日2010年12月30日
发明者夏惠, 张惠, 陶志勇, 高琪 申请人:张惠, 江苏省血吸虫病防治研究所, 陶志勇