一种脱毒水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的菌剂及工艺的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种脱毒水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的菌剂及工艺。弯曲芽孢杆菌NJNpd41，2012年12月31日保存于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号CGMCC?NO.7072。一种用NJNpd41水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的方法，包括将菜籽饼调含水量至50%，将NJNpd41菌液接入菜籽饼进行固体发酵，得农业氨基酸肥。使用该发明生产的农业氨基酸肥能够降解菜饼中所含的毒素的含量，显著促进茄子植株的生长、增加茄子的产量和提高茄子的品质。
【专利说明】一种脱毒水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的菌剂及工艺
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种脱毒水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的菌剂及工艺。
【背景技术】
[0002]菜籽饼资源丰富，其粗蛋白质含量约为37-42%，是一种宝贵的蛋白质资源。菜籽饼中的粗蛋白质80%以蛋白质形式存在，其余20%为游离氨基酸、芥酸、核酸等。其蛋白质绝大部分为球蛋白，氨基酸含量比较平衡(刘振中用菜籽饼制取氨基酸水解液的试验研究)。目前比较多方法是利用酸水解法利用菜籽饼中的氨基酸资源，但是工业费用较高且有较大的二次污染。本发明旨在筛选产蛋白酶微生物，利用其分解菜饼蛋白成农用氨基酸肥供植物利用。
[0003]菜籽饼中含有抗营养因子和有毒成份，对菜籽饼的利用造成很大的障碍。目前对菜籽饼脱毒主要有物理、化学和微生物脱毒法。物理脱毒法作用机理是钝化芥子酶活性，避免芥子酶将硫甙葡萄糖苷分解产生有毒物质。这种方法具有操作简单的优点，但它只能钝化芥子酶，硫甙、单宁、芥子碱和植酸等物质依然存在，没有根本解决菜籽饼的无毒化。化学脱毒方法是根据菜籽饼中的硫甙葡萄糖苷的结构和性质，用一定的化学试剂进行处理，使其失去原有毒性的方法。主要有水洗，醇类处理和双液相萃取法。化学脱毒法有一定的效果，但不能完全清除有毒物质，在工业利用还是存在一定的困难。微生物脱毒法主要利用庞杂的微生物区系和复杂的微生物酶系对菜籽饼中的有毒物质和抗营养因子进行降解。接种微生物后，利用微生物本身分泌出的芥子酶等酶系将硫甙分解成多种具有挥发性的异硫氰酸盐，主要有3- 丁烯基硫氰酸盐、4-戊烯基硫氰酸盐、2-羟基-3- 丁烯基异硫氰酸盐，还有少量的苯乙基异硫氰酸盐(孟宪金脱毒方法的研究进展)。微生物种类多，数量大、适应性强、生长快、易培养、代谢产酶系复杂，几乎可以分解一切天然物质。无论规模和数量，还是发酵作用、分解作用的彻底性，微生物的作用远远超过物理化学法。第一，酶系繁杂，分解硫甙的芥子酶多，能够水解复杂多变的硫甙；第二，`分解中间产物的酶系较复杂，能将其彻底分解，并合成自身物质；第三，菜籽饼的其它抗营养因子也能被微生物分解，如植酸、单宁、纤维素等，提高菜籽饼营养成分的利用率。因此，研究菜饼的脱毒生物酶解工艺，对于推进菜饼源农用氨基酸肥产业，意义重大。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于针对生产实践中的实际问题和需求，提供一种用于脱毒水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的菌剂。
[0005]本发明的另一目的是提供脱毒水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的工艺。
[0006]本发明的目的可通过以下技术方案实现:
[0007]弯曲芽孢杆菌(Bacillus flexus)NJNpd41，2012年12月31日保存于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.7072。
[0008]弯曲芽孢杆菌NJNpd41为革兰氏阳性细菌，菌落形态为不规则，表面湿润，呈淡黄色，锯齿状边缘。
[0009]一种用所述的弯曲芽孢杆菌NJNpd41生产的功能菌液，是将弯曲芽孢杆菌NJNpd41接种到发酵培养液，进行液体发酵生产所得，发酵生产的条件为:pH6.0~7.5，发酵温度范围30~35°C，搅拌速度为180~200转/分钟，发酵时间为20~24h，使发酵液中含菌IX IOltl个/ml ;所用发酵培养液配方为:葡萄糖10g/L，酵母膏lg，(NH4)2SO4L Og/L,NaCl0.5g/L，其余为水，ρΗ7.2-7.5。
[0010]本发明所述的弯曲芽孢杆菌NJNpd41在水解菜籽饼生产农用氨基酸肥中的应用。
[0011]一种用所述的弯曲芽孢杆菌NJNpd41水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的方法，包括将菜籽饼调含水量至40%~50%，优选50% ;将所述的功能菌液接入菜籽饼进行固体发酵，每吨菜籽饼中加入功能菌液50L~60L,优选50L ;固体发酵过程中每天翻堆I~2次,记录堆体温度，待温度回降至室温发酵结束，最后在温度不超过60°C的条件下将氨基酸有机肥的含水量蒸发至30%以下得农用氨基酸肥。
[0012]按照本发明所述的方法制备的农用氨基酸肥。
[0013]作为本发明的一种优选，所制备的农用氨基酸肥产品，菜籽饼毒素异硫氰酸酯含量0.73mg/g,恶唑烷硫酮含量1.71mg/g,分别比对照(直接添加清水发酵)降低了 64.6%和70.3%。产品中多肽及游离氨基酸总含量为15.05%，全氮含量为7.16%，总氮磷钾养分为
10.89%、有机质含量61.94%、发芽指数为80%以上、含水量质量比为25_30%。
[0014]本发明所述的农用氨基酸肥在促进茄子生长中的应用。
[0015]有益效果本发明提供一株用于脱毒水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的菌剂及其农用氨基酸肥的生产工艺。
`[0016]使用该发明生产的农业氨基酸肥成本低于传统工艺，堆肥过程简化，使用方便，同时发酵过程中弯曲芽孢杆菌NJNpd41菌株能够降解菜饼中所含的毒素的含量，增加的生物也能改善土壤品质。本发明对于保护生态环境，保护人民的身体健康，提高农产品的附加值具有重要的意义。
[0017]产品与目前市场上的产品相比具有如下优点:
[0018]I)利用弯曲芽孢杆菌NJNpd41对菜籽饼蛋白进行降解生产农用氨基酸肥料，操作简单，效率较高，肥料中庞大的微生物系统对土壤的改善有一定的作用。
[0019]2)弯曲芽孢杆菌NJNpd41利用复杂的酶系对菜籽饼中的有毒物质和抗营养因子进行降解。接种菌株NJNpd41后，能够将异硫氰酸酯和恶唑烷硫酮的含量降到安全值以下。国外有报道少孢根霉在堆肥过程中可以将异硫氰酸脂和恶唑烷硫酮含量分别降低43.1%和34%，而在菌株NJNpd41作用下，异硫氰酸脂和恶唑烷硫酮含量分别降低64.6%和70.3%。
[0020]3)试验结果表明，在茄子幼苗期和茄子大田种植施用本产品后，能显著促进茄子植株的生长、增加茄子的产量和提高茄子的品质。
【专利附图】
【附图说明】
[0021]图1.不同菌种转化菜饼产生多肽及游离氨基酸含量
[0022]图2.依据16S rDNA序列构建的NJNpd41号菌株与相关模式菌种的系统发育树
[0023]图3.不同接种量产生多肽及游离氨基酸含量
[0024]图4.41-C、CK-C堆肥过程中温度变化[0025]图5. 41C、CKC堆肥过程中多肽及游离氨基酸含量变化
[0026]生物材料保藏信息
[0027]NJNpd41，弯曲芽孢杆菌Bacillus flexus，2012年12月31日保存于中国微生物 菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科 学院微生物研究所，保藏编号CGMCC N0. 7072。
【具体实施方式】
[0028]实施例1菌种筛选
[0029]1、菜籽饼的获得
[0030]由江苏新天地生物肥料工程中心有限公司提供。
[0031]2、菌株的分离及鉴定
[0032]将海南采集回的土壤样品按1 :10(g/v)的比例加入无菌蒸馏水中，充分振荡后静 置30分钟，取3ml上清液加入菜籽饼培养基（10g菜籽饼加入到1L去离子水中），30°C震 荡培养5天后获得富集液。取0. 5ml富集液涂布LB酪蛋白平板，30°C培养24h。挑单个 菌苔，点接于LB酪蛋白培养基平板上，培养24h后观察透明圈的有无，若产生透明圈，分别 测量透明圈和菌落的直径，并计算其比值，选择比值较大的菌株进行进一步研究。按5%的 接种量接种菌株于200g生菜籽饼中，调含水量至50%，放入30°C培养箱固体发酵，每天调 含水量保持湿润，6天后取样茚三酮比色法测定多肽及游离氨基酸总含量（图1)。挑选出 转化氨基酸含量最高的41号菌株进行16s rDNA鉴定并送中国微生物菌种保藏管理委员 会普通微生物中心保存，16S rDNA的PCR反应的5’端引物5’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’ (Escherichia coli bases8to 27)，3，端引物 5，-TACCTTGTTACGACT T_3，(Escherichia coli basesl507tol492)。扩增反应体系如下：10XTaq聚合酶反应缓冲液5 ii L， dNTP (20mmol ? u L 0 4 u L,引物(25pmol ? u L :)各 2 u L, Mg2+ (25mmol ? u L :) 4 u L,菌体少 许，TaqDNA 聚合酶(5U ? u I71) 0. 5 u L,加水至 50 u L。反应条件：95°C变性 5min, 94。。30s， 55°C 30s，72°C lmin，30个循环；最后72°C延伸lOmin。PCR产物与0. 75%的琼脂糖凝胶上 电泳检测。挑选正确大小片段的PCR产物送上海美吉公司测序，根据测定完成的16S rDNA 序列，在RDP数据库（http ：//rdp. cme. msu. edu/index, jsp)中下载与转化菌株16S rDNA序 列同源的序列，同时在NCBI数据库（http ：//www. ncbi. nlm. nih. gov)在线查询分析，采用 MEGA3. 1软件构建16S rDNA系统进化树（图2)，41号菌株被确认为弯曲芽孢杆菌（Bacillus flexus)，送交中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏日期为2012年12月31 日，保藏号为CGMCC N0. 7072。
[0033]实施例2、功能菌菌剂的生产
[0034]将菌种保藏号为CGMCC N0. 7072的Bacillus flexus NJNpd41接种至发酵培养液 进行液体发酵生产，发酵条件为：pH7. 0，发酵温度范围30-35°C，搅拌速度为180-200转/ 分钟，发酵时间为24小时，得功能菌菌液，菌液的含菌或芽孢量> 101(1个/ml。所用发酵培 养液配制方法为，以配制1L培养基为例：葡萄糖10g,酵母膏lg, (NH4)2S041. 0g, NaClO. 5g, 其余为水，pH7. 2-7. 5 ;121°C灭菌 20min。
[0035]实施例3、固体发酵生 产农用氨基酸肥
[0036]3. 1固体发酵工艺的获得[0037]利用递进法获得固体发酵的工艺，首先将菌液以不同浓度加入菜籽饼堆肥中，发酵堆总重2kg(干重)，发酵5天，获得最佳菌液添加量(图3)，测定每天氨基酸变化得到最佳堆肥天数，获得最终固体发酵工艺。发酵方式如下:每吨固体有机物料中加入功能菌菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆I次，记录堆体温度(图4)，待温度回降至室温发酵结束(不同室温时间不等)，最后在温度不超过60°C的条件下将微生物有机肥的含水量蒸发至30%以下，包装出厂即为成品氨基酸有机肥。发酵完后测定各处理中的氨基酸的含量，结果如图，5%，16天接种堆肥为最佳配方，多肽及游离氨基酸达到干重15.05%以上(图5)。
[0038]3.2固体大堆发酵生产农用氨基酸肥
[0039]根据上述配方和工艺，将菜籽饼按含水量调至50%，发酵堆总重(干重)20kg，将蛋白酶降解菌NJNpd41接入混合堆，每吨固体有机物料中加入功能菌菌液IL进行条剁式固体发酵，每天翻堆I次，记录堆体温度，待温度回降至室温发酵结束；设计未加蛋白酶降解菌菜籽饼有机肥作为对照(CK)。发酵结束后新型氨基酸有机肥中多肽及游离氨基酸总含量为15.05% (干重)，比CK增加了 151.7%。最后再对农用氨基酸肥中残留菜籽饼毒素异硫氰酸酯及恶唑烷硫酮的含量进行检测，检测方法分别参考GB13087-91和GB13089-9，原料菜饼中异硫氰酸脂含量为2.06mg/g，恶唑烷硫酮为5.76mg/g。经过堆肥之后，CK处理中异硫氰酸脂含量为1.66mg/g,恶唑烷硫酮为4.28mg/g。41号菌处理后异硫氰酸酯含量最终为
0.73mg/g, 口恶唑烷硫酮含量最终为1.71mg/g。
[0040]研制成的氨基酸有机肥多肽及游离氨基酸总含量为15.05%、全氮含量为7.16%、总氮磷钾养分为10.89%、有机质含量61.94%。以上结果表明所研制配方和工艺完全能够最大化的发酵生产新型氨基酸有机肥，且该氨基酸有机肥完全能够符合国家标准。
[0041]实施例4、温室试验
[0042]I)促生盆栽试验在江苏新天地生物有机肥工程中心有限公司温室(江苏宜兴)里进行，共设2个对照一个处理，处理组为实施例3中3.2生产的新型氨基酸有机肥41C处理，对照组分别为菜籽饼不加入蛋白酶降`解菌处理(CKC)和化肥对照处理(化肥处理与41C等养分)。作物为茄子，每个处理9盆，每盆装2 kg土，肥料的添加量为1% (Dff)0肥料与土充分混合均匀，常规管理。定期测定爺子生长指数。结果见表1、表2、表3、表4、表5、表6和表7。I)株高:与两个对照相比，本专利研制的41C农用氨基酸肥能够增加植株的株高，较CKC比较移苗后二十天呈现出显著性差异，一直保持到移苗后50天。2)茎粗:与CKC处理相比，本专利研制的41C农用氨基酸肥能够增加植株的茎粗，移苗后二十天即表现出显著性差异。与化肥处理相比，30天以后同样达到显著性差异。3)倒三片长:与CKC和化肥对照相比，本专利研制的41C农用氨基酸肥能够增加植株的倒三片长，移苗后二十天即均表现出显著性差异。4)倒三叶宽:与CKC处理相比，本专利研制的41C农用氨基酸肥能够增加植株的倒三叶宽，移苗后二十天即表现出显著性差异。与化肥处理相比，30天以后达到显著性差异。5)叶绿素含量:与CKC处理相比，本专利研制的41C处理能够增加植株的叶绿素含量，移苗后二十天即表现出显著性差异。6)叶片数量:与CKC处理相比，本专利研制的41C处理能够增加植株的叶片数量，移苗后二十天即表现出显著性差异。7)地上部鲜重和干重:与CKC和化肥处理相比，本专利研制的41C处理能够增加植株的地上部鲜重和干重，移苗后20天即均表现出显著性差异。8)地下部鲜重和干重:与CKC和化肥处理相比，本专利研制的41C处理能够增加植株的地下部鲜重和干重，移苗后20即均表现出显著性差异。[0043]试验结果整体表明，本专利研制的氨基酸有机肥能够促进茄子植株的生长，本发明的配方和工艺能够显著促进功能菌的固体发酵效率，增加肥料的养分和去除原料中的毒素，最终促进茄子植株的生长。
[0044]2)促生大田试验在江苏宜兴某农业园里进行，共设5个对照一个处理，处理为本专利研制的新型氨基酸有机肥处理41C，对照分别为空白对照(BLK)，原料菜籽饼对照(C)、菜籽饼不加入蛋白酶降解菌发酵对照(CKC)、普通有机肥对照(OOF)和化肥对照(CF)。作物为茄子，每个处理3个小区，每个小区8m2，每小区种21棵苗，肥料的添加量为41C处理160Kg/亩，其他除BLK处理以外，均与41C等养分(养分不足用化肥补齐)，常规管理。测定各处理生产果实的产量及品质，结果见表8:41C较5个对照处理，硝酸盐含量最低，差异显著；可溶性糖含量，维生素C及蛋白质含量最高，并且差异显著，可见41C能够明显提高果实的品质。另外，果实产量方面，41C较5个对照处理也最高，并且也差异显著，可见41C能够提高作物的产量。不加菌发酵的CKC处理，相比化肥处理，除了维生素C比化肥显著性高以外，硝酸盐，可溶性糖，蛋白质以及产量均无显著性差异，而41C相比CF处理，硝酸盐显著降低，可溶性糖，维生素C，蛋白质以及果实产量均显著性提高，硝酸盐显著降低27%，可溶性糖，维生素C，蛋白质以及果实产量分别提高54%，24%，53%和25%。不发酵的菜饼C处理的产量仅仅比空白高，显著低于其他施肥处理。
[0045]大田试验最终表明,Bacillus flexus41能够有效的促进菜饼的酶解,增加其中游离氨基酸和寡肽的含量，发酵研制成的氨基酸有机肥，能够显著促进大田茄子的产量和提闻爺子的品质。
[0046]表1不同处理对爺子株高的影响(单位:cm)
[0047]
【权利要求】
1.弯曲芽孢杆菌(Bacillusflexus)NJNpd41，2012年12月31日保存于中国微生物菌种保藏管理委员普通微生物中心，保藏编号CGMCC N0.7072。
2.一种用权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌NJNpd41生产的功能菌液，其特征在于是将弯曲芽孢杆菌NJNpd41接种到发酵培养液，进行液体发酵生产所得，发酵生产的条件为:PH6.0~7.5，发酵温度范围30~35°C，搅拌速度为180~200转/分钟，发酵时间为20~24h，使发酵液中含菌I X IOltl个/ml ;所用发酵培养液配方为:葡萄糖10g/L，酵母膏lg，(NH4)2SO4L Og/L, NaCl0.5g/L，其余为水，ρΗ7.2-7.5。
3.权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌NJNpd41在水解菜籽饼生产农用氨基酸肥中的应用。
4.一种用权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌NJNpd41水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的方法，其特征在于包括将菜籽饼调含水量至40%~50%，将权利要求2所述的功能菌液接入菜籽饼进行固体发酵，每吨菜籽饼中加入菌液50L~60L，固体发酵过程中每天翻堆I~2次，记录堆体温度，待温度回降至室温发酵结束，最后在温度不超过60°C的条件下将氨基酸有机肥的含水量蒸发至30%以下得农用氨基酸肥。
5.根据权利要求4所述的用权利要求1所述的弯曲芽孢杆菌NJNpd41水解菜籽饼生产农用氨基酸肥的方法，其特征在于包括将菜籽饼调含水量至50%，将权利要求2所述的功能菌液接入菜籽饼进行固体发酵，每吨菜籽饼中加入菌液50L，固体发酵过程中每天翻堆I~2次，记录堆体温度，待温度回降至室温发酵结束，最后在温度不超过60°C的条件下将氨基酸有机肥的含水量蒸发至30%以下得农用氨基酸肥。
6.按照权利要求4所述的方法制备的农用氨基酸肥。
7.权利要求6所述的农用氨基酸`肥在促进茄子生长中的应用。
【文档编号】C12R1/07GK103881948SQ201410089043
【公开日】2014年6月25日 申请日期:2014年3月11日 优先权日:2014年3月11日
【发明者】沈其荣, 李 荣, 刘红军, 黄蓉, 文春燕, 张瑞福, 乔策策, 邵铖 申请人:南京农业大学