据库例如NCBI、Genbank获得）， 或通过获得唾液酸转移酶和/或待修饰的蛋白的序列，来获得感兴趣蛋白（例如唾液酸转 移酶）的编码序列。所述序列可以克隆到适合的质粒载体中，并在适合的宿主生物中放大， 如大肠杆菌。在载体的扩增后，可以将DNA构建体切出，从载体的剩余部分纯化，并引入可 以用于生成转基因哺乳动物的表达载体中。所述转基因哺乳动物将具有整合到它们的基因 组中的所需的转基因蛋白。
[0102] 在载体的扩增后，可以使用适合的5'和3'控制序列切出DNA构建体，从载体的剩 下部分纯化出来并用于产生转基因哺乳动物，所述转基因哺乳动物在其基因组中整合了所 需的非糖基化的相关转基因蛋白。相反地，对于一些载体，如酵母人工染色体（YACs)，没有 必需从载体移除组装的构建体；在这些情况中，扩增的载体可以直接用于制造转基因哺乳 动物。编码序列可以可操作连接到控制序列，其使得编码序列能够在转基因非人哺乳动物 的乳中表达。
[0103] 适合用于在转基因哺乳动物的乳中指导产生唾液酸转移酶和/或待修饰的蛋白 生成的DNA序列可以携带衍生于天然来源的乳蛋白的5'启动子区。该启动子因此在激素 和组织特异性因子的控制下，并在泌乳中的乳腺组织中最有活性。在一些实施方案中，所述 启动子是山羊β酪蛋白启动子。所述启动子可以可操作地连接到指导蛋白前导序列产生 的DNA序列，所述蛋白前导序列指导转基因蛋白穿过乳腺上皮分泌到乳中。在一些实施方 案中，可以添加3'序列来改善mRNA的稳定性，所述3'序列可以衍生于天然分泌的乳蛋白。
[0104] 如本文所使用的，"前导序列"或"信号序列"是编码蛋白质分泌信号的核酸序列， 当与编码转基因蛋白的下游核酸分子可操作地连接时指导分泌。所述前导序列可以是天然 的人前导序列，人为来源的前导序列，或从与用于指导转基因编码序列转录的启动子相同 的基因获得，或从通常从细胞（例如哺乳动物乳腺上皮细胞）分泌的另一种蛋白获得。
[0105] 在一些实施方案中，所述启动子是乳特异性启动子。如本文所使用的，"乳特异性 启动子"是在分泌蛋白到乳中的细胞（例如乳腺上皮细胞）中天然指导基因表达的启动子， 包括例如酪蛋白启动子，例如α-酪蛋白启动子（例如aS-1酪蛋白启动子和aS2-酪蛋 白启动子），β-酪蛋白启动子（例如山羊β酪蛋白基因启动子（DiTullio,BIOTECHNOLOGY 10:74-77,1992)，γ-酪蛋白启动子，κ-酪蛋白启动子，乳清酸性蛋白（WAP)启动子 (Gortonetal·，BIOTECHNOLOGY5:1183-1187,1987)，β-乳球蛋白启动子（Clarket al.，BIOTECHNOLOGY7:487-492, 1989)，以及α-乳清蛋白启动子（Soulieretal.，FEBS LETTS. 297:13, 1992)。乳腺组织中特异性活化的启动子也包括在这一定义中，如例如小鼠 乳腺肿瘤病毒（MMTV)的长末端重复序列（LTR)启动子。
[0106] 如本文所使用的，编码序列和调控序列当它们以如下的方式连接时称为"可操作 地连接"，所述方式使得将编码序列的表达或转录置于调控序列的影响或控制下。为了将编 码序列翻译成为功能性的蛋白，所述编码序列可操作地连接到调控序列。如果对5'调控序 列中启动子的诱导导致编码序列的转录，并且两个DNA序列之间连接的性质没有⑴导致 移码突变的引入，（2)干扰启动子区指导编码区转录的能力，或（3)干扰对应的RNA转录物 翻译成为蛋白的能力，则两个DNA序列称为可操作地连接。因此，如果启动子区能够实现 DNA序列的转录，使得所得的转录物可以翻译成为所需的蛋白或多肽，则启动子区可操作地 连接到编码序列。
[0107] 如本文所使用的，"载体"可以是可以通过限制和连接接受期望的序列插入以在不 同遗传环境之间转运或用于在宿主细胞中表达的众多核酸的任一个。载体通常由DNA组 成，虽然也可用RNA载体。载体包括但不限于质粒和噬菌粒。克隆载体是能够在宿主细胞 中复制，并且特征还在于一个或多个内切核酸酶限制性位点的载体，在所述内切核酸酶限 制性位点处所述载体以可确定的方式剪切，并可以对该内切核酸酶限制性位点连接期望的 DNA序列，使得新的重组载体保留其在宿主细胞中复制的能力。在质粒的情况中，所需序列 的复制可以随着质粒在宿主细菌中拷贝数量的增加发生多次，或者由于宿主通过有丝分裂 复制每个宿主仅发生一次。在噬菌体的情况中，复制可以在溶解期期间活跃地发生，或在溶 原性期期间被动地发生。表达载体是可以通过限制和连接接受期望的DNA序列插入，使得 其可操作连接到调控序列并可以表达为RNA转录物的载体。载体可以进一步含有一个或多 个标志物序列，其适合用于鉴定已经或尚未用所述载体转化或转染的细胞。标志物包括例 如编码增加或减少对抗生素或其它化合物的抗性或敏感性的蛋白的基因，编码其活性可通 过本领域已知的标准测定法检测的酶（例如β-半乳糖苷酶或碱性磷酸酶）的基因，以及 明显影响转化或转染的细胞、宿主、集落或斑块的表型的基因。优选的载体是那些能够自主 复制并表达其可操作地连接的DNA片段中存在的结构基因产物的载体。
[0108] 本发明通过以下实施例进一步阐述，其决不应解释为进一步的限制。贯穿本申请 所引用的所有参考文献（包括文献参考文献、公告的专利、公布的专利申请，以及共同待批 的专利申请）的全部内容在此通过提述并入本文，尤其是对于在上文中引用的教导。然而， 对任意参考文献的引用不意图承认该参考文献是现有技术。 实施例
[0109] 实施例1
[0110] 测定乳腺中唾液酸转移酶的水平
[0111] 乳腺中产生的蛋白的不完全唾液酸化的一个原因可以是与通常分泌血清蛋白的 肝中发现的唾液酸转移酶水平相比，乳腺中唾液酸转移酶的水平的限制。为了评估这一假 说，从来自山羊肝的CDNA文库中分离了 2,6唾液酸转移酶基因。该CDNA在Northern印迹 中用作探针来测定乳腺相对肝中的基因表达水平。通过Northern印迹，在乳腺中发现的唾 液酸转移酶表达的水平约为肝中发现的水平的百分之一，提示乳腺中的唾液酸化能力的限 制。
[0112] 从山羊肝克隆ST6 Gall
[0113] 使用从山羊肝分离的RNA构建了cDNA文库。人ST6的已知序列用于设计能够扩 增山羊序列的PCR引物。在RT-PCR反应后，分离了编码2, 6唾液酸转移酶（ST6Gal1)的 全长cDNA。山羊ST6Gall的蛋白序列与人蛋白的序列相当（见图1:GENEID: 100861310 ST6GAL1，ST6β-半乳糖酰胺α-2, 6-唾液酸转移酶1 [山羊];图1描述了ST6Gall的山 羊（顶部："查询"；SEQIDN0:1)和人序列（底部："对象"，SEQIDN0:2))。
[0114] 编码2, 6唾液酸转移酶的基因连接到山羊β酪蛋白表达载体，产生质粒BC2541 ST6Gall(见图2)。该载体包括山羊β酪蛋白启动子来对山羊乳腺指导连接基因的表达。
[0115] 转基因山羊的产生
[0116] BC2541ST6Gall转基因用于产生在其乳腺中表达ST6Gall的转基因山羊。所得山 羊在它们的基因组中携带β酪蛋白唾液酸转移酶。如下文所示，所述转基因山羊在它们的 乳中产生唾液酸转移酶。
[0117] 在乳腺中产生了唾液酸转移酶（"体外"活性）
[0118] 使用测试唾液酸转移酶的酶促活性的测定法，证实了转基因山羊的乳腺中的唾液 酸转移酶的存在。即，唾液酸转移酶可以使Ν-连接复合糖上的暴露的1，4半乳糖唾液酸化。
[0119] 重组α-l抗胰蛋白酶（ΑΑΤ)当产生于转基因山羊的乳中时为50%唾液酸化的， 而从血清分离的ΑΑΤ为几乎完全唾液酸化的（例如，市售的Α丨felastin? )。在转基因 山羊的乳中产生的重组α-?抗胰蛋白酶作为靶标用于使用转基因山羊的乳中产生的唾 液酸转移酶的唾液酸化反应。来自在乳腺中表达唾液酸转移酶的山羊的乳以及核苷酸糖 CMP-唾液酸与唾液酸化不足的ΑΑΤ孵育。另外，市售的唾液酸转移酶用作对照。通过在等 点聚焦凝胶（IRF凝胶）上运行孵育的ΑΤΤ，确认了孵育后唾液酸添加到唾液酸化不足的 ΑΑΤ。蛋白（ΑΑΤ)上唾液酸化水平的增加导致较低的等电点（pi)，导致该蛋白在凝胶上运 行较慢。预期重组AAT(其为50%唾液酸化）比阳性对照（从血清分离的完全唾液酸化的 AATAlfa丨asi:in? )在凝胶上运行更高。
[0120] 图3A的左边组示出了唾液酸化实验，其比较AAT(第2道）和使用市售的唾液酸 转移酶的混合物处理的唾液酸化不足的AAT(第3道）。正如预期的，经受唾液酸转移酶的 AAT(第3道）在IEF凝胶上比没有经历唾液酸转移酶的AAT(第2道）运行更低。
[0121] 图3A的右边组中描述了相似的结果。使用唾液酸转移酶混合物（第3道）或来 自乳的唾液酸转移酶的纯化批次（第4和5道）处理唾液酸化不足的AAT与未处理的唾液 酸化不足的AAT(第2道）相比导致唾液酸化水平的增加以及向下的移动。
[0122] 图3B描述的凝胶示出了Alfalastin?,-种唾液酸化形式的AAT(第1道），使用 来自产生唾液酸转移酶的转基因山羊的乳处理的AAT(第2道和第7道），使用来自对照动 物的乳处理的AAT(第3道和第8道），使用来自对照动物的乳和转基因产生的唾液酸转移 酶处理的AAT(第4道），使用缓冲液和转基因产生的唾液酸转移酶处理的AAT(第5道）， 以及使用缓冲液处理的AAT(第6道）。
[0123] 因此，如图3所示，转基因山羊的乳中产生的唾液酸转移酶ST6Gall"在体外"是 有活性的，并能使唾液酸化不足的AAT唾液酸化到血浆衍生的完全唾液酸化的AAT的水平。
[0124] 使用转基因产生的唾液酸转移酶处理的AAT的糖基化模式
[0125] 从转基因动物的乳中纯化转基因产生的唾液酸转移酶，并用于使目标蛋白：唾液 酸化不足的AAT唾液酸化。将唾液酸化不足的AAT经受唾液酸转移酶后，评价AAT的糖基 化来确认唾液酸是否添加到AAT糖基化侧链的暴露的Gal残基。
[0126] 如图4所示，使用从产生唾液酸转移酶的转基因山羊的乳收获的唾液酸转移酶进 行"体外"唾液酸化将AAT上的大多数单唾液酸化的双触角复合糖转化为双唾液酸化的形 式。下方的图示出了唾液酸化前的AAT而上方的图示出了经受唾液酸化之后的AAT。
[0127] 乳腺中的唾液酸转移酶活性（"体内"）
[0128] 对在乳腺中转基因产生的唾液酸转移酶评价其增加也由乳腺分泌的重组蛋白的 唾液酸化水平的能力。
[0129] 为了测试ST6Gall在乳腺是否有活性，评价了内源性蛋白的唾液酸化水平。乳铁 蛋白是一种内源性乳产生的蛋白，其携带三个N-连接的糖基化位点。从携带ST6Gal1基因 并在其乳中产生唾液酸转移酶的山羊乳中分离了乳铁蛋白（图5,第2列）。也从对照动物 分离了乳铁蛋白，该对照动物不携带ST6Gall基因（图5,第1列）。两种乳铁蛋白样品连 同重复制备物使用N-聚糖酶处理，用2-氨基苯甲酸（2-AA)衍生化，并通过HILICLC-MS/ (MS)用荧光检测分析糖基化模式。结果（图5)表明在转基因哺乳动物中，唾液酸转移酶的 活性增加，因为乳铁蛋白上双唾液酸化的N-连接的糖的量从总糖的25%增加到34%。双 唾液酸化的增加与单唾液酸化的糖的转化相关，这从对照中的18%减少到表达唾液酸转移 酶的山羊中的5%。因此，乳腺中产生的ST6Gall将大多数唾液酸化不足的单-唾液酸化的 N-连接的糖转化为双-唾液酸化的形式。因此，ST6Gall唾液酸转移酶在乳腺中有活性， 并能够在乳腺中将唾液酸添加到