pyl-0-D-thi〇-galactoside，IPTG)进行诱导，融合蛋白开始 表达，于25°C培养箱中培养。2化后使用Beckman离屯、机离屯、收菌，40(K)rpm离屯、20min，弃去 上清。用35mL裂解液重悬底部的E.coli细胞，冻存于-80°C冰箱中用于W后纯化或者直接超 声破碎。
[0040] 将细菌悬液放在冰水浴中，用超声破碎仪3s on/3s off的脉冲破碎15min，直到细 胞悬液比较透亮为止。超声完成后，使用日立离屯、机进行离屯、，14000巧m 20min，弃去沉淀 取上清。融合蛋白带有化S6标签，用儀柱纯化。Ni2+-NTA胶先用d地2〇冲洗，然后用Binding buffer平衡，之后与上清混合，在4°C冰箱中混合化后，即可进行纯化。首先将Ni2+-NTA胶和 上清的混合物加入重力流穿柱中，使上清流出，而融合蛋白会结合在Ni2+-NTA胶上。之后用 含30mM咪挫和300mM咪挫的Binding buffer洗脱杂蛋白和目的蛋白。目的蛋白经过10K MWC0浓缩管(Mi 11 ipore)离屯、浓缩后，使用化ctor Xa酶进行酶切。将酶按照1:3000(g/g)的 比例加入目的蛋白，室溫酶切16h(20-25°C)。酶切之后进行反挂儀柱，即酶切后的蛋白与用 Binding buffer平衡好的Ni2+-NTA胶混合化，His-SUMO标签挂在儀柱上，纯化时，流穿出来 的是目的多肤毒素。所有洗脱的蛋白样品均用Tricine-SDS-PAGE进行验证(如图3所示）。
[0041] 将多肤毒素冻干，再加入少量的dd出0使其溶解，用运种方式浓缩毒素后使用高效 液相色谱化PLC)进行纯化。多肤毒素混合物在C18色谱柱上使用1%到69%线性梯度的乙腊 和0.1%TFA溶液W5mL/min流速分离。谱峰于214nm和254nm波长检测，人工收集目的蛋白， 用ESI-MS(电喷雾电离质谱)进行验证，计算得到SSD609多肤毒素的质量大小为5623.細曰， 与天然SSD609-致(如图5所示）。将蛋白溶液冻干得到白色固体粉末，备用。
[0042] 实施例3:SSD609二硫键重建
[0043] 由于纯化出来的SSD609折叠状态不够均一，6个半脫氨酸形成的二硫键可W有许 多种连接方式，因此我们对蛋白进行重折叠，使二硫键正确连接。将冻干后的SSD609粉末小 屯、地用分析天平称量，读出重量。然后根据摩尔质量（SSD609是5624.5g/mol)算出物质的 量。配制变复性溶液。根据SSD609的物质的量，计算需要加入的溶液数量(保持SSD609的浓 度处于100μΜ-200μΜ之间。如ΙμL?οΙ的SSD609溶于5血，则物质的量浓度为200μΜ，符合要求）。 此举为了防止蛋白浓度过高，二硫键形成二聚或多聚。按照GSH(还原型谷脫甘肤）：GSSG(氧 化型谷脫甘肤）：P邱tide(多肤蛋白）= 100:10:1的摩尔比，称取相应的G甜和GSSG加入溶有 SSD609的变复性溶液中。调节抑7.8,4°C静置24-4化。G甜和GSSG能够诱导硫醇和二硫键之 间的交换反应，模拟生理状态使非天然的二硫键打开，然后重新折叠形成热力学稳定的天 然状态。再次经过HPLC纯化，分离出状态均一的SSD609组分(二硫键重建前后HPLC对比图如 图4所示），该样品冻干后即可用于后续实验。
[0044] 实施例4:中国仓鼠卵巢细胞(C册)表达KCNQ1/KC肥1钟离子通道，验证SSD609的生 理功能
[004引在脂质体的帮助下，将PCDNA3.1-KCNQ1、pcDNA3.1-KC肥 1、pcDNA3.1-EGFP质粒共 转染到CK)细胞中，在巧光显微镜下选取发绿色巧光的细胞，采用膜片错电生理技术记录全 细胞电流。局部给予不同浓度的SSD609,对比给药前后KCNQ1/KC肥1钟离子通道电流的大 小，验证SSD609的生理功能（图6)。
[0046] 电压刺激：电压维持在-80mV，给予去极化电压刺激，从-80mV~+60mV，每次增加 20mV，维持2s，引出KCNQ1/KC肥1钟离子电流，之后在-30mV测试尾电流，再回到-80mV。
[0047] 细胞外液：15〇111]\1胞(：1，4111]\11((：1，2111]\10日(：12，1111]\11旨(：12，1〇111]\1皿？65，抑7.4，渗透 压310m0sm
[004引 电极内液：140mM KCiaOmM NaCl，5mM EGTAaOmM 肥PES，lmM MgATP，0.2mM NaGTP，pH 7.4，渗透压295111〇3111。
【主权项】
1. 一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素 SSD609的方法，包括如下步 骤： (1) 获取SSD609蛋白的DNA序列，所述DNA序列如SEQ ID No.l所示； (2) 将SSD609的DNA序列连接到带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上，构建 pET28-His 6-SUM0-Factor Xa-SSD609质粒； (3) 将pET28-His6-SUM0-Factor Xa-SSD609质粒转化进入大肠杆菌，培养后采用异丙基 硫代半乳糖苷（18<^1'<^71-0-〇-1:11；[〇飞313〇1:〇81(16，1?16)诱导表达，离心后收菌； (4) 将细菌悬液超声破碎后离心取上清液，用镍柱纯化，洗脱后得到纯化的His6-SUM〇-SSD609融合蛋白； (5) His6-SUM0-SSD609融合蛋白用Factor Xa酶进行酶切，得到含有His6-SUM0标签和 SSD609多肽毒素的蛋白混合液；将该混合液与镍柱混合，His 6-SUM0标签与镍柱结合，而 SSD609多肽毒素则作为流穿液被收集，并用HPLC进一步纯化； (6) 经HPLC纯化后的SSD609多肽毒素使用GSH(还原型谷胱甘肽)和GSSG(氧化型谷胱甘 肽)进行二硫键重建，获得状态均一的SSD609多肽毒素； (7) 再次使用HPLC对SSD609多肽毒素进行纯化，并质谱验证SSD609的分子量大小，冻干 备用。2. 根据权利要求1所述的一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素 SSD609 的方法，其特征在于，所述步骤(3)中蛋白表达的具体方法如下： 将pET28-His6-SUM0-Factor Xa-SSD609质粒转化进入Escherichia coli BL21(DE3) gold细胞中，37°C培养箱中生长24h;挑选单克隆，在4mL LB小管中扩增后加入到600mL含50 yg/mL卡那霉素的LB液态培养基中，37°C培养，转速为225rpm;当菌液0D600达至1」0.8时加入 终浓度为〇.5mM IPTG进行诱导，融合蛋白开始表达，于25°C培养箱中培养;20h后离心机离 心收菌，4000rpm离心20min，弃上清液；用35mL裂解液重悬底部的E. coli细胞，收集细菌悬 液，备用。3. 根据权利要求1所述的一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素 SSD609 的方法，其特征在于，所述步骤(4)中蛋白纯化的具体方法如下： 将细菌悬液用超声破碎仪破碎，离心后取上清，得到含有杂蛋白的蛋白混合液;Ni2+-NTA胶先用ddH20冲洗，再用Binding buffer平衡;平衡后的Ni2+-NTA胶与蛋白混合液混合， 使Hi S6-SUM0-SSD609蛋白与Ni2+-NTA胶结合;将结合了蛋白的Ni2+-NTA胶加入重力流穿柱， 用含30mM咪唑的Binding buffer洗去非特异性结合的杂蛋白，再用含有300mM咪唑的 Binding buffer冼脱His6-SUM0-SSD609融合蛋白。4. 根据权利要求1所述的一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素 SSD609 的方法，其特征在于，所述步骤(5)中蛋白酶切和纯化的具体方法如下： HiS6-SUM0-SSD609融合蛋白使用 10K MWC0浓缩管(Mi 11 ipore)离心浓缩，用Factor-Xa 酶的酶切buffer将浓缩后的His6-SUM0-SSD609融合蛋白稀释至10mL;Factor-Xa酶按照1: 3000(g/g)的比例加入 His6-SUM0-SSD609 融合蛋白溶液，20-25°C 酶切 16h，此时 His6-SUM〇-SSD609融合蛋白已被酶切开，分别为His6-SUM0标签和SSD609多肽毒素;酶切后的混合蛋白 溶液与用Binding buffer平衡好的Ni2+-NTA胶混合lh，His-SUMO融合标签结合在Ni2+-NTA 胶上，流穿出来的即为多肽毒素 SSD609蛋白；将该SSD609蛋白冻干，加入ddH20溶解，用HPLC 进一步纯化:含有多肽毒素SSD609的溶液在C18色谱柱上使用1 %到69 %线性梯度的乙腈和 0 · 1 % TFA溶液以5mL/min流速分离;谱峰于214nm和254nm波长检测，人工收集目的蛋白。5.根据权利要求1所述的一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609 的方法，其特征在于，所述步骤(6)中SSD609二硫键重建的具体方法如下： 将得到的SSD609多肽毒素冻干，加入到变复性溶液中。该变复性溶液为0.33M NH4Ac和 0.5M GnHCl混合液，所述多肽毒素SSD609蛋白在变复性溶液中的浓度在100μΜ-200μΜ之间。 按GSH(还原型谷胱甘肽）：GSSG(氧化型谷胱甘肽）：多肽毒素SSD609= 100:10:1的摩尔比， 称取相应的GSH和GSSG加入溶有多肽毒素SSD609蛋白的变复性溶液中；调节pH至7.8，4°C静 置24-48h;静置后的溶液再次经过HPLC纯化，分离出状态均一的SSD609组分。
【专利摘要】本发明涉及一种制备拥有类似天然状态生理功能的蜈蚣多肽毒素SSD609的方法。该方法是通过基因合成方法制备SSD609多肽毒素的DNA序列，用PCR方法在其前面插入Factor-Xa酶切位点，并克隆至带有His6亲和标签和SUMO助溶标签的pET28载体上。将质粒转化进入大肠杆菌，异丙基硫代半乳糖苷诱导高效表达。细菌破碎后使用镍柱进行纯化，并用Factor-Xa酶切断His6-SUMO融合标签和SSD609，反挂镍柱除去His6-SUMO。SSD609用HPLC进一步纯化后，加入一定比例的GSH和GSSG，使SSD609中二硫键重新连接成热力学稳定的状态，构象变得均一。再次用HPLC纯化SSD609，冻干后备用。本发明所提供的制备SSD609方法操作简便，产量多，纯度高，成本较低，且拥有类似天然状态下SSD609的生理功能，可用于该蜈蚣毒素的大量制备。
【IPC分类】C12N15/70, C12N15/12, C12R1/19, C07K1/36, C07K1/16, C07K1/22, C12N1/21
【公开号】CN105543234
【申请号】CN201610035565
【发明人】田长麟, 张隆华, 孙培蓓, 王晨阳, 周莉
【申请人】中国科学技术大学先进技术研究院
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月19日