伏马毒素b1核酸适配体链置换探针的筛选及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，设及核酸适配体的应用与开发，具体为伏马毒素 Bi核 酸适配体链置换探针的筛选及应用。
【背景技术】
[0002] 伏马毒素(fumonisin)是一类主要由串珠镶刀菌产生的真菌毒素。伏马毒素主要 存在于玉米及其制品中，此外还存在于大米、小麦、大麦、高梁、魏豆、芦算、啤酒、牛奶和饲 料等农产品及其加工品中。调查表明：世界各国的玉米及其制品，无论是人食用的食品还是 动物用的饲料，普遍都受到伏马毒素的污染，其中玉米的污染率达60% W上。目前至少已鉴 定出15种伏马毒素类似物，其中伏马毒素 Bi(FBi)的毒性最强。研究证实，伏马毒素可引起马 脑白质软化症和猪肺水肿综合症。世界卫生组织国际肿瘤研究中屯、（IARC)于1993年评价了 伏马毒素的毒性，并将其归类为可能的人类致癌物；国际食品法典委员会(CAC)的巧CFA最 近的评价结果指出其具有肾脏毒性。农产品中存在的伏马毒素已成为相关农产品安全消 费、国际贸易和现代农业产业发展的限制因素，对人的健康和畜牧业发展构成潜在危害。因 此，研究建立科学先进、准确可靠的伏马毒素系列监控技术，是控制我国农产品伏马毒素污 染、保障农产品安全消费和人民身体健康的迫切需求。
[0003] 由于伏马毒素不具有强的紫外吸收和巧光基团，因此不像其它真菌毒素那样易于 分析检测。基于抗体的免疫检测技术是真菌毒素的主流检测技术，其中作为快速检测技术 的巧光偏振检测技术在国外已经比较成熟，但是其所用的F&巧光标记物如6-(4,6-二氯Ξ 嗦基）氨基巧光素(6-DTAF)相当昂贵，导致检测成本较高，不利于该技术的大面积推广应 用。
[0004] 核酸适配体作为一类单链寡核巧酸，与祀分子发生特异性相互作用前后空间构象 会发生相应的变化，与抗体相比具有可体外筛选获得、热稳定性好、易于化学合成和修饰等 优点，甚至能区分单抗无法实现的单个取代基差别的祀分子。2010年，Maureen McKeague报 道了伏马毒素 Bi 的核酸适配体（Int.J. Mol. Sci. 2010，11:4864-4881 ;doi : 10.3390/ i加 S11124864)，但是针对该核酸适配体的相关应用报道较少。
[0005] 针对我国农产品质量安全检测的需求，充分利用巧光偏振检测技术和核酸适配体 技术的优势，本发明公开了 FBi核酸适配体链置换探针的筛选，并开发了基于该链置换探针 的FBi巧光偏振检测技术，有助于建立适合我国国情的农产品伏马毒素监控技术体系，满足 当前我国对农产品伏马毒素污染监控关键技术的迫切需要，对保障农产品消费安全和人民 生命健康意义重大，应用前景广阔。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种伏马毒素 Bi核酸适配体的链置换探针，并提供基于该 链置换探针的伏马毒素 Bi巧光偏振检测方法，具有特异性高、稳定性好、经济的特点。
[0007] 为实现上述目的本发明采用W下技术方案：
[0008] 一种伏马毒素 Bi核酸适配体链置换探针，所述置换探针为一段单链寡核巧酸，其 序列如SEQ ID N0:1。
[0009] 所述探针5'端修饰有FAM巧光基团。
[0010] 所述探针与伏马毒素 Bi核酸适配体互补。
[00川所述伏马毒素 Bi核酸适配体序列如沈Q ID NO:6所示。
[0012] 所述伏马毒素 Bi核酸适配体链置换探针是通过巧光光谱法和巧光偏振法筛选的。
[0013] 伏马毒素 Bi核酸适配体链置换探针作为玉米和小麦中伏马毒素 Bi的巧光偏振检测 分析应用。
[0014] 本发明的有益效果：
[0015] (1)本发明公开了 FBi核酸适配体链置换探针的筛选，为后续基于FBi核酸适配体链 置换探针的信号放大传感技术研发奠定了基础。
[0016] (2)本发明开发的基于该链置换探针的FBi巧光偏振检测技术采用FBi核酸适配体 作为分子识别元件，与基于抗体的免疫检测技术相比，具有非常好的特异性；同时，因核酸 的合成成本非常低廉，且已经商业化，大大降低了检测FBi的成本。
[0017] (3)本发明公开的基于该链置换探针的FBi巧光偏振检测技术为均相检测技术，重 现性好，且操作简单方便且可实现大量样品的平行检测，有助于建立适合我国国情的农产 品伏马毒素监控技术体系，满足当前我国对农产品伏马毒素污染监控关键技术的迫切需 要，对保障农产品消费安全和人民生命健康意义重大，应用前景广阔。
【附图说明】
[0018] 图1为链置换探针筛选图；
[0019] 图2为链置换探针优化筛选图；
[0020] 图3为巧光光谱法评价FBi核酸适配体链置换探针的活性；
[0021 ]图4为巧光偏振法评价FBi核酸适配体链置换探针的活性；
[0022] 图5为标准工作曲线。
【具体实施方式】：
[0023] -种伏马毒素 Bi核酸适配体链置换探针，所述置换探针为一段单链寡核巧酸，其 序列如沈Q ID NO: 1所示。
[0024] 所述探针5'端修饰有FAM巧光基团。
[0025] 所述探针与伏马毒素 Bi核酸适配体互补。
[0026] 所述伏马毒素 Bi核酸适配体序列如SEQ ID NO:6所示。
[0027] 所述伏马毒素 Bi核酸适配体链置换探针是通过巧光光谱法和巧光偏振法筛选的。
[0028] 伏马毒素 Bi核酸适配体链置换探针作为玉米和小麦中伏马毒素 Bi的巧光偏振检测 分析应用。
[0029] W下结合具体实施例，对本发明进行详细说明，具体步骤如下：
[0030] 本发明中所用的。81核酸适配体序列为2010年1曰11'66111沈6曰邑116报道的。81核酸适 配体其序列如SEQ ID N0:6所示。与该核酸适配体互补的单链寡核巧酸序列的设计原则为： 一方面要保证室溫条件下杂交复合物不能解链;另一方面要保证FBi与核酸适配体结合时， 能将巧光基团修饰的单链寡核巧酸片段竞争下来。
[0031 ] 利用生物学在线计算软件化ttp: //unafold. rna. a化any. edu/)，在1 X反应缓冲 溶液条件下，溫度参数设为37°C，DNA浓度设置为O.luM，计算单链寡核巧酸片段与核酸适配 体杂交的融链溫度Tm，要求25°C含化含60°C。实验中所设计的所有单链寡核巧酸片段如表1 所示，5'端均修饰有FAM巧光基团；FBi核酸适配体及其他巧光修饰探针均由上海生工公司 合成;FBi购于PRIB0LAB公司，磁性纳米粒子(直径Ιμπι)购于郑州英诺生物科技有限公司。
[0032] 表1实验中所设计的单链寡核巧酸片段
[0033]
[0034] *:Tm计算利用在线软件ht1:p://unafold.rna.a化any.edu/，参数设置：DNAat 37 °C，[DM] = le-7M，[Na+] = 0.105M，[Mg2+] = 0.003M。
[0035] IX反应缓冲溶液溶解的FBi核酸适配体储备液用之前经95°C5min，冰水浴5min处 理。首先将FBi核酸适配体与巧光素修饰的链置换探针杂交形成杂交复合物，然后利用亲和 素-生物素相互作用将该复合物组装到磁性纳米粒子表面。充分洗涂后用50nM的FBi标准溶 液