于37°C溫度下轻轻震荡解育20min，进行竞争反应。同时设置已腊/水比例为1:1的混合溶 液作为空白对照。离屯、取上清测量溶液的巧光强度。激发光波长为488nm，发射光波长为 520nm。
[0036] 活性链置换探针的判断标准为:FBi存在的情况下，巧光基团修饰的链置换探针能 够从磁性纳米粒子上解离，上清的巧光强度较强;FBi不存在的情况下，巧光基团修饰的链 置换探针不能从磁性纳米粒子上解离，上清的巧光强度较弱或无巧光。据此判断链置换探 针的活性。结果如图1所示，初步筛选结果显示，CP4和CP10效果较好:CP4反应前后，上清巧 光强度变化大约1200a.U. ;CP10反应前后，上清巧光强度变化大约1400a.U.。由此可见，链 置换探针CP4和CPIO在最佳反应条件下既能与FBi核酸适配体稳定杂交，即在没有FBi存在的 时候，杂交复合物不会轻易解离，因此磁分离之后上清的巧光强度比较弱；同时，运两条链 置换探针又不影响FBi与核酸适配体的结合，即在FBi存在时，FBi与核酸适配体的结合能够 轻松将其置换下来，因此磁分离之后上清的巧光强度有所增强。据此判断，链置换探针CP4 和CP10活性较好，并用于进一步的优化。通过对链置换探针CP4和CP10的进一步截短、序列 优化，我们设计了 CP4-l、CP4-2、CP10-l、CP10-2、CP10-3等链置换探针，实验结果如图2所 示。链置换探针CP4-2反应前后，上清巧光强度变化大约3000a.U.，巧光增强大约6倍，活性 最好。
[0037] (1)巧光光谱法评价FBi核酸适配体链置换探针的活性
[0038] 利用亲和素-生物素相互作用将FBi核酸适配体与链置换探针的杂交复合物组装 到磁性纳米粒子表面，充分洗涂后加入20化L含有终浓度为50nM FBi的1 X反应缓冲溶液， 于37°C溫度下进行竞争反应20min，离屯、取上清测量溶液的巧光强度，激发光波长为488nm， 发射光波长为520nm。同时设置已腊/水比例为1:1的混合溶液作为对照。由图3可知，FBi核 酸适配体链置换探针有很高的活性:在没有FBi存在的时候，杂交复合物不会轻易解离，因 此磁分离之后上清的巧光强度比较弱;在FBi存在时，FBi与核酸适配体的结合能够轻松将其 置换下来，因此磁分离之后上清的巧光强度明显增强。
[0039] (2)巧光偏振法评价FBi核酸适配体链置换探针的活性
[0040] FBi核酸适配体储备液用之前经过95°C5min，冰水浴5min处理一下。然后将FBi核酸 适配体和FBi链置换探针按照终浓度1:1的比例杂交:5μΜ FBi核酸适配体化L，5yM FBi链置 换探针化L，10X反应缓冲溶液（200mM Tris，lM 化Cl，20mM MgC12,50mM KCiaOmM CaC12， pH 7.6)2化L，加纯净水调整反应体系的总反应体积到20化L。将反应混合物于37°C溫度下 杂交比。然后，取10化上述杂交复合物，100化10 X反应缓冲溶液到一次性巧光偏振玻璃试 管中，最后用纯净水稀释到ImL，混合均匀，测量反应体系的初始巧光偏振值Po。加入50nM的 FBi标准溶液反应后，再测量一次反应体系的巧光偏振值P。同时设置已腊/水比例为1:1的 混合溶液作为对照。由图4可知，FBi核酸适配体链置换探针有很高的活性:在没有FBi存在的 时候，巧光标记杂交复合物不会轻易解离或者只有极少部分解离，因此反应前后复合物的 分子量几乎没有变化，所W反应前后体系的A P值非常小;在FBi存在时，FBi与核酸适配体的 结合能够轻松将CP4-2链置换探针置换下来，形成游离的巧光标记CP4-2链置换探针，因反 应前巧光标记杂交复合物的分子量较大，反应后游离的巧光标记CP4-2链置换探针的分子 量较小，所W反应前后体系的A P值比较大。
[0041] -种FBi核酸适配体链置换探针在检测玉米样品中伏马毒素 Bi上的应用，将该链置 换探针应用于FBi的巧光偏振检测分析，具体步骤如下：
[0042] (1)玉米样品中FBi的提取:称取20g已粉碎的玉米样品，加入lOOmL憐酸盐缓冲液， 振荡提取化，过滤，滤液样品备用。
[0043] (2)杂交复合物的制备:FBi核酸适配体储备液用之前经过95°C5min，冰水浴5min 处理一下。5μΜ FBi核酸适配体化L，5yM FBi链置换探针化L，10X反应缓冲溶液（200mM TrisaOOM 化Cl，20mM MgCl2,50mM KCiaOmM CaCl2,抑 7.6)20yL，加纯净水调整反应体系 的总反应体积到2(K)yL。将反应混合物于37°C溫度下杂交化，室溫下放置备用。
[0044] (3)检测步骤：
[0045] ①反应前，体系巧光偏振值Po的测量:取10化上述杂交复合物，100化10 X反应缓 冲溶液到一次性巧光偏振玻璃试管中，最后用纯净水稀释到ImL，混合均匀，测量反应体系 的初始巧光偏振值Po。
[0046] ②反应后，体系巧光偏振值P的测量：1化L上述杂交复合物，100化10 X反应缓冲 溶液，5化L 0-200nM的FBi祀标溶液或者10化L样品滤液，用1 X反应缓冲溶液稀释到ImL，混 合均匀，37°C下反应20min，测量反应体系的最终巧光偏振值P。
[0047] 最终，用P对标准溶液中FBi浓度作图获得工作曲线如图5所示，未知样品中FBi所产 生的巧光强度的变化值与工作曲线对照确定其浓度。
【主权项】
1. 一种伏马毒素也核酸适配体链置换探针，其特征在于:所述链置换探针为一段单链寡 核苷酸，其序列如SEQ ID NO: 1所示。2. 如权利要求1所述的伏马毒素也核酸适配体链置换探针，其特征在于:所述探针5 '端 修饰有FAM荧光基团。3. 如权利要求1所述的伏马毒素也核酸适配体链置换探针，其特征在于:所述探针与伏 马毒素也核酸适配体互补。4. 如权利要求3所述的伏马毒素也核酸适配体链置换探针，其特征在于:所述伏马毒素 Βι核酸适配体序列如SEQ ID NO:6所示。5. 伏马毒素也核酸适配体链置换探针的筛选，其特征在于:所述伏马毒素也核酸适配体 链置换探针是通过荧光光谱法和荧光偏振法筛选的。6. 伏马毒素也核酸适配体链置换探针作为玉米和小麦中伏马毒素出的荧光偏振检测分 析应用。
【专利摘要】本发明属于生物技术领域，涉及核酸适配体的应用与开发，具体为伏马毒素B1核酸适配体链置换探针的筛选及应用。本发明公开了FB1核酸适配体链置换探针的筛选，为后续基于FB1核酸适配体链置换探针的信号放大传感技术研发奠定了基础。基于该链置换探针的FB1荧光偏振检测技术采用FB1核酸适配体作为分子识别元件，与基于抗体的免疫检测技术相比，具有成本低廉、特异性高的特点，且该技术为均相检测技术，重现性好，操作简单方便且可实现大量样品的平行检测，有助于建立适合我国国情的农产品伏马毒素监控技术体系，满足当前我国对农产品伏马毒素污染监控关键技术的迫切需要，对保障农产品消费安全和人民生命健康意义重大，应用前景广阔。
【IPC分类】C12N15/115, G01N33/68
【公开号】CN105543231
【申请号】CN201610019729
【发明人】刘继红, 王红旗, 李淑芳, 尹海燕, 马莹, 李静, 祁玉峰, 张军锋
【申请人】河南省农业科学院农业质量标准与检测技术研究所
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年1月11日