提高马铃薯茎块抗氧化能力的基因及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明设及基因工程技术领域，特别是设及提高马铃馨茎块抗氧化能力的基因及 其应用，可W赋予植物更多的积累四种单咖啡酷奎尼酸等，W及二种黄酬醇类Ξ糖等物质， 并提高马铃馨抗氧化能力。
【背景技术】
[0002] 单咖啡酷奎尼酸，是由咖啡酸(Caffeic acid)与奎尼酸(Quinic acicUl-径基六 氨没食子酸)生成的缩酪酸，是植物体在有氧呼吸过程中经莽草酸途径产生的一种苯丙素 类化合物主要存在于茄科植物，W及咖啡，苹果，及梨中。近20年来，国内外学者就单咖啡酷 奎尼酸的植物化学和药理学进行了深入研究，发现运类化合物具有一些重要的生物活性， 极具临床价值。根据咖啡酷在奎尼酸上的位置不同，从理论上讲，可分为1-咖啡酷奎尼酸， 3-咖啡酷奎尼酸，4-咖啡酷奎尼酸和5-咖啡酷奎尼酸(绿原酸）。在人体中，单咖啡酷奎尼酸 主要直接被小肠吸收(Williamson et al.，2000)，并具有清除其中过氧自由基的能力 (Nardini et al., 2002)〇
[0003] 1-咖啡酷奎尼酸在NF-κΒ途径中作为潜在抑制子具有抗癌能力，不仅在免疫反应 的初期起作用，同样可W在免疫进程的各个阶段产生影响(Aggarwal et al.，2006;化an et al.，2013)。3-咖啡酷奎尼酸作为人类饮食中最丰富的多酪类物质，具有预防肝脏疾 病，高血脂W及肥胖的生物学功能（Sakulnarmrat et al., 2012; Hu et al., 2015)。4- 咖啡酷奎尼酸是中药玫瑰茄中消炎的重要成分物质（Zhen et al.，2016)。5-咖啡酷奎尼 酸俗称绿原酸，主要生物活性包括(1)对透明质酸酶及葡萄糖-6-憐酸酶的抑制作用；（2)对 自由基的清除及抗脂质过氧化作用；（3)抗诱变作用；（4)保肝利胆作用；巧)抗菌、抗病毒及 解疫等作用。
[0004] 目前主要通过常规手段利用天然材料(银杏叶、洋葱、巧樣、各种中药材等)为基础 的化学方法获得，受到原材料来源不足、含量偏低、初提物成份复杂及相关药理毒性不清等 因素的严重限制，由少数公司控制下游产品的生产和销售，价格居高不下。
[000引目前广泛种植的马铃馨仅含有少量的黄酬醇(其中黄酬醇类Ξ糖近乎痕量)和单 咖啡酷奎尼酸。利用马铃馨作为生物反应器生产植物疫苗、化合物等正成为基因工程研究 的一个热点。马铃馨是重要的转基因受体植物，农杆菌介导的马铃馨茎段转化法从报道之 后一直得到广泛应用。但是如何能够提高马铃馨体内多种单咖啡酷奎尼酸及搬皮素-葡萄 糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧及山糞酪-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧两种黄酬醇类Ξ糖的含量， 进而提高马铃馨茎块抗氧化能力一直是现有常规技术无法解决的问题。
【发明内容】
[0006]本发明的目的就是针对上述存在的问题而提供一种提高马铃馨茎块抗氧化能力 的基因及其应用。本发明提供了一种W增加马铃馨茎块中积累单咖啡酷奎尼酸包括1-咖啡 酷奎尼酸(提高3.51倍）、3-咖啡酷奎尼酸(提高5.45倍）、4-咖啡酷奎尼酸(提高5.37倍）、5- 咖啡酷奎尼酸(绿原酸）(提高3.72倍)等，W及通过对葡萄糖基转移酶基因的调控提高搬皮 素-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧(提高13.50倍)及山糞酪-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧(提 高4.46倍)等黄酬醇类Ξ糖物质含量，并提高马铃馨茎块抗氧化能力（2倍W上）的cDNA片 段CQAIP1，其基因序列如SEQ ID NO:l所示，该片段从拟南芥中获得，本发明利用马铃馨自 身茎块特异性表达启动子化tatin-2,驱动外源基因 CQAIP1在马铃馨茎块中特异表达，大大 提高了马铃馨茎块中4种单咖啡酷奎尼酸及巧巾黄酬醇类Ξ糖类物质含量，从根本上大幅度 提高马铃馨茎块的抗氧化能力。
[0007] 本发明W栽培型马铃馨作为生物反应器生产多种单咖啡酷奎尼酸及高含黄酬醇 类Ξ糖生物制品，实行产业化;也可W此获得马铃馨的工程细胞，通过细胞培养方式生产四 种单咖啡酷奎尼酸及两种黄酬醇类Ξ糖。同时本发明中马铃馨用的转化载体可W通过雌二 醇的诱导作用剔除筛选标记，得到具有食用安全性的马铃馨品种，进行品种培育。
[0008] 本发明的提高马铃馨茎块抗氧化能力的基因及其应用技术方案为，本发明首先提 供了提高马铃馨茎块抗氧化能力的基因 CQAIP1，其核酸序列如SEQ ID N0:1所示：
[0009] 本发明是通过特异引物CQAIPl Fl，其基因序列如SEQ ID N0:2所示:acttttgtgg tcagtggaat a,和CQAIPl Rl，其基因序列如SEQ ID N0:3所示：aacggatcaa tcaatatcat，采 用现有技术高保真扩增全长SEQ ID NO: 1基因，获得基因序列如SEQ ID NO: 1所示的基因片 段。
[0010] 之后通过特异引物化tatin-2 F1，其基因序列如SEQ ID N0:4所示：atgactagtg ttcagtaatt gaccggagac，和化tatin-2 Rl，其基因序列如SEQ ID N0:5所示：atggaattca attttgttgg tgctttgag，W马铃馨品种中蔬4号基因组DNA为模版，组合扩增出编码 ?曰1曰1111-2启动子的0臟序列，其基因序列如569 10^:6所示：
[0011]在获得上述两段基因片段之后，采用趾ol-Spel双酶切后去掉GFP片段并用上述两 段基因片段替换掉常用植物表达载体PX6-GFP中的GFP基因，最终即可获得植物表达载体 pX6-Patatin-2::CQAIPl〇
[0012] 获得的植物表达载体pX6-Patatin-2: :CQAIP1，导入农杆菌工程菌株AGLl。通过茎 段法转化马铃馨品种Desiree，获得PCR转基因植株，通过特异引物CQAIP1 F1，其基因序列 如SEQ ID N0:2所示，和CQAIP1 R1，其基因序列如SEQ ID N0:3所示，扩增转入载体的 CQAIP1整体序列，验证转基因阳性植株。利用HPLC对转基因阳性株系的马铃馨茎块进行全 部单咖啡酷奎尼酸与两种黄酬醇类Ξ糖含量检测，转基因材料的茎块中上述物质的含量都 有明显的提高，通过ABTS+方法测量马铃馨茎块的抗氧化能力相比野生型有明显的提高。采 用qRT-PCR(Real time如anti化tive PCR)技术，通过葡萄糖基转移酶基因引物GF1，其基 因序列如沈Q ID N0:7所示：ggatggaact cgattctgga，和GR1，其基因序列如沈Q ID N0:8 所示：Caccttcaat ttgcagacca，对葡萄糖基转移酶基因进行表达量分析，其基因序列如 沈Q ID NO:9所示：
证实提高搬皮素-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧及山糞酪-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧 两种黄酬醇类Ξ糖含量，主要原因在于葡萄糖基转移酶基因表达量的大幅度提高。
[001引在上述技术的基础上，根据已经克隆的CQAIP1基因作探针，从cDNA和基因组文库 中筛选可得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技 术，也可W从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的CQAIPl基因 W及任何感兴趣的一段 DNA或与其同源的一段DNA。采用W上技术，可W分离得到包含CQAIP1基因的序列包括基因 片段的基本上相当于SEQ ID NO: 1所示的DNA序列，或者其功能相当于SEQ ID NO: 1所示序 列的亚片段，将运一序列与合适的载体连接，可W转入植物细胞，产生转基因植物。
[0014]本发明的有益效果为:本发明首次提供了一种通过赋予茄科植物积累四种单咖啡 酷奎尼酸包括1-咖啡酷奎尼酸、3-咖啡酷奎尼酸、4-咖啡酷奎尼酸、5-咖啡酷奎尼酸(绿原 酸）；及黄酬醇类Ξ糖包括搬皮素-葡萄糖-葡萄糖巧-鼠李糖巧及山糞酪-葡萄糖-葡萄糖 巧-鼠李糖巧等，进而大幅度提高茄科植物抗氧化能力的cDNA片段，该片段对上述两种黄酬 醇类Ξ糖物