华中五味子提取物在制备治疗扑热息痛所致肝损伤药物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开华中五味子提取物在制备治疗扑热息痛(APAP)所致肝损伤药物中的应用，所述华中五味子提取物的主要成分为五味子酯甲和五味子甲素。通过实验发现华中五味子提取物可显著抵抗因APAP所致肝损伤引起的血清ALT及AST水平升高和肝细胞坏死，抑制肝细胞中还原性谷胱甘肽的消耗，从而减轻APAP所致的肝损伤程度，机制涉及激活Nrf2-ARE信号通路，表现为上调Nrf2的mRNA表达、促进Nrf2核转位、启动下游药物代谢酶及抗氧化基因的转录。实验结果表明华中五味子提取物对APAP造成的肝损伤有治疗效果，为临床防治APAP所致肝损伤提供了新的方法和手段。
【专利说明】华中五味子提取物在制备治疗扑热息痛所致肝损伤药物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明属于医药【技术领域】，具体涉及华中五味子提取物在制备治疗扑热息痛所致肝损伤药物中的应用。
【背景技术】
[0002]扑热息痛(Acetaminophen, APAP)，又名对乙酰氨基酚，是目前世界范围内应用最广泛的0TC类解热镇痛药。当前，上市的感冒药和镇痛药中，含有APAP的已超过100种，仅以国内常见的药物为例，泰诺、百服宁、白加黑、感康、快克、999感冒灵、必理通、康必得、速效伤风胶囊、泰诺林、瑞迪菲、维C银翘片等均含有该成分。
[0003]APAP在治疗剂量时用药安全、疗效确切，但服用过量可引起肝损伤、急性肝衰竭(Acute liver failure, ALF)甚至死亡。在美国、英国、澳大利亚及其它欧美国家,APAP过量是药物性肝损伤和ALF最常见的原因。因此，APAP的肝毒性一直受到广泛关注和重视。APAP过量服用时，大量的APAP由CYP450酶氧化形成N-乙酰对苯醌亚胺(NAPQI)。NAPQI导致谷胱甘肽(GSH)耗竭，并与细胞内蛋白特别是线粒体蛋白共价结合，引发线粒体氧化应激。通过氧化应激反应和活性氧簇R0S的生成，可激活c-Jun氨基末端激酶(JNK)的磷酸化和核转位，进一步促进和放大线粒体氧化应激，引发线粒体膜流动性降低、线粒体通透性转换孔(MPT)的开放，诱发线粒体功能异常，最终导致肝细胞的损伤、凋亡和坏死。
[0004]N-乙酰半胱氨酸(NAC)是目前临床上用于治疗APAP急性中毒的经典药物，但该药物的局限之处在于其治疗窗较窄，对APAP中毒急性后期的治疗无效，且长期给予高剂量NAC可干扰正常肝细胞线粒体代谢过程，阻断NF-kB信号通路从而抑制APAP肝损伤后的肝再生。因此，寻找新的有效治疗APAP肝毒性的药物具有重要意义。
[0005]华中五味子ScAj'sanc/ra sphenanthera Rehd.et ffils.为民间常用中药，具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效，主要用于久嗽虚喘、遗梦滑精、遗尿尿频、久泻不止、自汗、盗汗、津伤口渴、气短脉虚、内热消渴及心悸失眠等症。现代药理研究表明，华中五味子具有扩张血管、镇静、祛痰、止咳、抗衰老、提高免疫力等作用，特别是保护肝脏的作用。但目前未见华中五味子提取物在治疗APAP所致肝损伤方面的相关报道。
【发明内容】
[0006]本发明的发明目的在于提供华中五味子提取物在制备治疗扑热息痛所致肝损伤药物中的应用。 [0007]本发明的上述目的通过如下技术方案予以实现:
华中五味子提取物在制备治疗扑热息痛所致肝损伤药物中的应用，所述华中五味子提取物中五味子酯甲和五味子甲素的质量分数均不少于2.5%。
[0008]所述华中五味子提取物的制备方法为:取华中五味子100 g加8倍量水煎煮1 h，过滤去除滤液，药渣烘干后粉碎，用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5 h,过滤，合并滤液，浓缩，即得华中五味子提取物浸膏。
[0009]本发明所述药物还包括医药领域常规的药物载体，如填充剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂、防腐剂等。
[0010]所述填充剂为淀粉、糊精、糖粉、甘露醇、乳糖或磷酸氢钙。
[0011]所述黏合剂为纤维素衍生物、明胶、淀粉浆或聚维酮。
[0012]所述湿润剂为水或乙醇。
[0013]所述崩解剂为干燥淀粉、羧甲基淀粉钠、碳酸钙或碳酸氢钠。
[0014]所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇或十二烷基硫酸镁。
[0015]所述矫味剂为糖精钠、蔗糖或甜蜜素。
[0016]所述防腐剂为苯甲酸、山梨酸或尼泊金。
[0017]本发明所述药物可以为医药领域常规剂型，包括胶囊剂、颗粒剂、片剂、散剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等。
[0018]根据实际需要，所述药物的剂型还可以是缓释剂或控释剂。
[0019]现有技术中，虽然已有五味子果仁乙醇提取物(五仁醇)及其有效成分之一五味子醇乙预先24小时给药能显著降低大剂量扑热息痛肝中毒所致的小鼠死亡率，但是中药提取物的化学成分及药效作用往往因药材种类、药用部位、所采用的提取方法的不同而存在明显的差异，而本发明运用指纹图谱技术对华中`五味子果实的乙醇提取物中化学成分进行了表征，其主要成分为五味子酯甲和五味子甲素。
[0020]本发明所述华中五味子提取物治疗扑热息痛所致的肝损伤是激活Nrf2_ARE信号通路，表现为上调Nrf2的mRNA表达、促进Nrf2核转位、启动下游药物代谢酶及抗氧化基因的转录，从而减轻肝细胞坏死。
[0021]本发明具有如下有益效果:
本发明实验以一次性过量给予APAP致小鼠急性肝损伤为模型，这种模型所造成的肝脏损伤主要以肝细胞坏死为主，血清中ALT及AST酶活性快速升高。急性肝损伤形成后给予华中五味子提取物，可显著抵抗因APAP所致肝损伤引起的血清ALT及AST水平升高和肝细胞坏死，抑制肝细胞中还原性谷胱甘肽的消耗，激活Nrf2-ARE信号通路，从而减轻APAP所致的肝损伤程度，实验结果表明本发明华中五味子提取物对APAP造成的肝损伤有治疗效果，为临床防治APAP所致肝损伤提供了新的方法和手段。
【专利附图】
【附图说明】
[0022]图1为华中五味子提取物化学指纹图谱；其中A为6种木脂素成分对照品的色谱图出为华中五味子提取物的化学指纹图谱，其中峰1为五味子醇甲，峰2为五味子醇乙，峰3为五味子酯甲，峰4为五味子甲素，峰5为五味子乙素，峰6为五味子丙素；
图2为华中五味子提取物对APAP诱导小鼠急性肝损伤模型血清中ALT、AST酶活性的影响结果图；
图3为华中五味子提取物对APAP诱导小鼠急性肝损伤模型肝细胞坏死程度的影响结果图(HE染色的肝脏病理切片)；
图4为华中五味子提取物对APAP诱导小鼠急性肝损伤的肝脏线粒体内GSH水平的影响结果图；图5为华中五味子提取物对APAP诱导小鼠急性肝损伤的肝脏Nrf2 mRNA及核内蛋白表达的影响结果图；
图6为华中五味子提取物对APAP诱导小鼠急性肝损伤的肝脏Nrf2下游靶基因mRNA表达的影响结果图。
[0023]其中A为空白对照组，B为华中五味子提取物组，C为APAP组，D为APAP/NAC组，E为APAP/华中五味子提取物组。
【具体实施方式】
[0024]下面结合具体实施例对本发明作进一步的解释说明，但具体实施例并不对本发明作任何限定。除非特别说明，实施例中所涉及的试剂、方法均为本领域常用的试剂和方法。
[0025]实施例1华中五味子提取物指纹图谱的建立
采用高相液相色谱法建立华中五味子提取物的化学指纹图谱，并对主要成分进行含量测定，用于下文动物试验计算华中五味子的给药剂量。
[0026](1)华中五味子提取物的制备:
取华中五味子100 g,加8倍量水煎煮1 h，滤过，弃去滤液，药渣烘干后粉碎，用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，滤过，合并滤液，浓缩，即得华中五味子提取物浸膏。
[0027](2)指 纹图谱分析样本的制备:
取华中五味子提取物浸膏0.5 g，精密称定，用乙醇溶解，超声60min，加乙醇定容至10ml，经0.22 Mm微孔滤膜过滤，滤液用于指纹图谱的分析。
[0028](3)色谱条件:
SHIMADZU高相液相色谱仪，包括LC-20AD 二元高压泵，SIL-20A自动进样器，CT0-20A柱温箱，Sro-M20A 二极管阵列检测器，D⑶-20A3脱气机，CBM-20A控制器，LCsolution工作站。Hypersil BDS C18色谱柱(150 mm X 4.6 mm 1.d., 5 Mm);流动相:水(A)_ 乙腈(B)；梯度洗脱程序:40 ~50% B (0 ~10 min)，50% B (10 ~20 min)，50 ~80% B (20 ~40min), 80 ~90% B (40 ~41 min), 90 ~100% B (41 ~50 min), 100 ~40% B (50 ~51min), 40% B (51 ~60 min);柱温:35 V ;流速:1 ml/min ;检测波长:230 nm ;进样量:5μ?。
[0029]从图1可以看出，华中五味子提取物中主要成分为五味子酯甲和五味子甲素，质量分数均大于2.5% (依次为2.6%, 2.9%)，其他木脂素成分如五味子醇甲、五味子醇乙、五味子乙素、五味子丙素等含量低，质量分数均小于0.1%(依次为0.06%, 0.07%, 0.07%, 0.09%)。
[0030]实施例2华中五味子提取物治疗扑热息痛所致肝损伤的试验
(1)动物模型
雄性C57BL/6小鼠，6-8周龄，有中山大学实验动物中心提供(动物合格证号SCXK(粤)2011-0029)。在标准实验条件下饲养:温度(23±2 V )，湿度(55±10%)，12小时光照-12小时黑暗循环，自由摄取水和食物。小鼠随机分成5组，分别为空白对照组(生理盐水)，华中五味子提取物组(以五味子酯甲计，9.2 mg/kg, p.0.), APAP组(400 mg/kg,
1.p.), APAP与华中五味子提取物合用组(APAP预处理,4 h后给予含9.2 mg/kg五味子酯甲的华中五味子提取物，Ρ.ο.)，APAP与NAC合用组(APAP预处理，4 h后给予200 mg/kgNAC, p.0.)。小鼠分别于华中五味子提取物给予后12、24 h处死；采集的血液进行血液生化指标分析，采集的肝脏进行组织病理学检查及分子机制研究。
[0031](2)血清ALT、AST酶活性的测定
按照ALT及AST检测试剂盒说明操作，采用Beckman CX5全自动生化分析仪测定血清ALT、AST酶活性。结果如图2所示。
[0032](3)肝脏组织学分析
肝组织依次经过10%中性福尔马中林固定、组织修切、石蜡包埋、常规切片、HE染色、乙醇剃度脱水、透明、封片进行光学显微镜观察肝细胞的坏死情况。结果如图3所示。
[0033]从图2和图3可以看出，APAP建模16 h后(即华中五味子提取物给予12 h)，相比于空白对照组，APAP组小鼠血清ALT、AST酶活性显著升高；相比于APAP组，华中五味子提取物治疗给药组的小鼠血清ALT、AST酶活性的显著下降。此外，华中五味子提取物给予24h后，APAP组小鼠肝小叶中央静脉周围出现大面积的肝细胞坏死，APAP/NAC组肝脏坏死灶内有较多的出血灶，而APAP/华中五味子提取物组小鼠肝小叶中央静脉区域肝细胞损伤程度明显减轻。以上结果提示了华中五味子提取物对APAP所致小鼠肝损伤具有确切的治疗作用。
[0034](4)肝脏线粒体中GSH的测定
肝组织用4 °C预冷的生理盐水洗涤，加入肝重9倍量的生理盐水并在玻璃匀浆器内研磨，于4 °C >2500 rpm离心10 min;取上清液，于4 °C > 10000 rpm离心15 min,弃上清液,所得沉淀即为纯化的线粒体。加入0.2 ml预冷的生理盐水，超声破碎30 s，于4 °C、4000rpm离心10 min。按照GSH检测试剂盒说明书操作步骤，取上清液用酶标仪检测405 nm处的吸收度值。结果如图4所示。
[0035]从图4可以看出，华中五味子提取物可明显增加肝脏线粒体内GSH含量，抑制APAP所致GSH耗竭。`
[0036](5)qRT_PCR 检测
按照Trizol试剂的说明书抽提小鼠肝脏总RNA，按照RT试剂盒说明书将RNA逆转录为cDNA，按照qRT-PCR试剂盒说明书检测特定基因的mRNA表达量。实验涉及的引物序列如表1所述。
[0037]表1.引物序列
【权利要求】
1.华中五味子提取物在制备治疗扑热息痛所致肝损伤药物中的应用，其特征在于，所述华中五味子提取物中五味子酯甲和五味子甲素的质量分数均不少于2.5%。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述华中五味子提取物的制备方法为:取华中五味子100 g加8倍量水煎煮1 h，过滤去除滤液，药渣烘干后粉碎，用8倍量70%乙醇回流提取2次，每次1.5 h，过滤，合并滤液，浓缩，即得华中五味子提取物浸膏。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的治疗扑热息痛所致肝损伤的机制涉及激活Nrf2-ARE信号通路，表现为上调Nrf2的mRNA表达、促进Nrf2核转位、启动下游药物代谢酶及抗氧化相关基因的转录，从而减轻肝细胞坏死。
4.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物还包括药物载体。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述药物载体为填充剂、黏合剂、湿润剂、崩解剂、润滑剂、矫味剂或防腐剂中的一种或多种。
6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述填充剂为淀粉、糊精、糖粉、甘露醇、乳糖或磷酸氢钙；所述黏合剂为纤维素衍生物、明胶、淀粉浆或聚维酮。
7.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述湿润剂为水或乙醇；崩解剂为干燥淀粉、羧甲基淀粉钠、碳酸钙或碳酸氢钠。
8.根据权利要求5所述 应用，其特征在于，所述润滑剂为滑石粉、硬脂酸、硬脂酸钙、硬脂酸镁、聚乙二醇或十二烷基硫酸镁；所述矫味剂为糖精钠、蔗糖或甜蜜素；所述防腐剂为苯甲酸、山梨酸或尼泊金。
9.根据权利要求1-8中任一项所述应用，其特征在于，所述药物的剂型包括胶囊剂、颗粒剂、片剂、散剂、溶液剂、乳剂、混悬剂。
10.根据权利要求1-8中任一项所述应用，其特征在于，所述药物的剂型包括缓释剂或控释剂。
【文档编号】A61P1/16GK103638109SQ201310692090
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】毕惠嫦, 黄民, 范晓梅, 姜伊鸣, 王莹, 陈攀 申请人:中山大学