专利名称：酶法合成胆红素的制作方法
酶法合成胆红素属于以动物血液为材料使用酶法合成胆红素。
胆红素为100多种中成药制剂的主要成份，如人工牛黄、感冒清、扑热息痛片、银翘解毒丸等，因此市场需求量大。现国内外所用的胆红素都是从动物胆汁中提取的，但胆汁中天然胆红素含量相当低，猪胆汁为万分之四左右，牛胆汁中仅有万分之二。又由于胆汁原料缺乏，利用不充分，使胆红素市场价格昂贵。
近年来，国际上的胆红素的合成方面主要是化学合成法，如Bonne和McDonagn发表的用25mg氯化血红素进行偶合氧化的方法，得到四种胆绿素异构体，其比例接近1∶1∶1∶1，然后用硼氢化钠还原碱解制备出胆红素的四种异构体。这种化学合成法，操作繁杂，所用化学试剂昂贵，合成的四种异构体又不易分离，而适合药用的只是胆红素1Xα，其余三种1Xβ、1Xγ、1Xδ不仅无药理作用，而且对人体健康不利。1992年由Gosauer和Plieninger利用现代化技术的胆红素全合成方法，采用吡咯化合物为原料，通过亚甲基桥连接成胆绿素再还原成胆红素，这种方法要求的条件苛刻，成本昂贵。
国内对胆红素的研究主要是从胆汁中提取胆红素的工艺和方法的改进。如胆红素钙盐间接提取法，该方法落后，生产周期长，但收率稳定在万分之三左右，适合大规模生产，离子交换树脂法适合于小规模生产，树脂吸附不完全，收率低仅万分之一点六左右，较好的方法是色层快速提取法，生产周期短，一般4小时左右，操作简便，收率达万分之三至四。国内也有学者在从事化学合成胆红素的研究，利用血红素为原料，化学合成得到胆红素的四种异构体，但分离方法尚未很好解决，且成本高。
本发明旨在以动物血液为原料，用酶法一步合成无异构体的胆红素产品，解决国内外在胆红素合成上尚未解决的上述问题。
实现本发明的技术方案是，以动物血液为原料一步合成胆红素的工艺如下(1)在新鲜动物血中加入8%柠檬酸钠抗凝剂，在温度为5～10℃，速率3000r.p.m条件下离心15’，得到的血红蛋白液以10000r.p.m高速捣碎5’，破碎细胞成血红蛋白浆;
(2)在血红蛋白浆中，按新鲜血量的5%加入重组血红素加氧酶系的混合酶液和3倍血红蛋白浆量、pH为7.4的磷酸缓冲液上反应柱，同时在反应柱中加入2%的H2O2和5%葡萄糖液，在37℃温度条件下反应5小时;
(3)在经酶解的反应液中加入1N的氢氧化钠溶液，调节pH至11，并煮沸3’;
(4)碱解液在5℃温度条件下，以3000r.p.m速率离心15’去除蛋白;
(5)在上清液中按1∶1的重量比加入氯仿液，再调pH至4.5～5.0，分层，收集氯仿混合液;
(6)氯仿混合液经旋转蒸发浓缩后减压，在50℃温度下回收氯仿得胆红素液;
(7)胆红素液用无水乙醇、乙醚洗涤除去杂质得到胆红素，再在60℃温度中真空干燥为胆红素成品。
重组血红素加氧酶系混合酶液是从新鲜动物肝、脾制得的血红素加氧酶、胆绿素还原酶和NAOPH-细胞色素C还原酶以1∶1∶1的比例混合，加入pH7.4的磷酸缓冲液配制成50mM的酶液，并加入5%的肝糜浆即成。
下面进一步详述本发明。
关于血红素的卟啉环氧化断裂的机制虽然尚未完全了解，但已经知道，在生物体内网状内皮系统(主要是脾和肝脏中的星形细胞)内含有活泼的血红素加氧酶，它在氧分子(O2)和NAOpH存在下，可将铁卟啉环上α-甲炔基(-CH＝)氧化断裂，释放出CO和Fe+2，并使两侧的吡咯环羟化，形成胆绿素，后者又在胆绿素还原酶的作用下，从NAOPH接受两个质子(H+)和两个电子(e-)而还原成胆红素(见下列代谢途经)。
血红素加氧酶系引起血红降解的产物是专一性的胆绿素1Xα，因血红素加氧酶同血红素的结合是通过血红素-Fe并列结合到酶的组氨酸残基上，结果使卟啉环α-甲炔基桥断裂形成特异性的胆绿素1Xα，这种胆色素又被胆绿素还原酶催化还原成胆红素1Xα。
在动物和人体细胞中血红蛋白分解代谢产生的血红素被血红素加氧酶系(即NAOPH-细胞色素还原酶、血红素加氧酶和胆绿素还原酶)催化降解成胆红素1Xα。前两种酶存在于网状内皮系统中，后一种酶存在于胞浆中，以不均匀状态分布。Hino等人报告，血红素加氧酶分布在接近微粒体膜的表面，且催化的活性部位暴露到细胞膜的表面，血红素被氧化成胆绿素发生在微粒体膜，胆绿素还原胆红素可能发生在膜-胞浆界面。本发明从牛、猪等动物组织中提取纯化得到NAOPH-细胞色素C还原酶、血红素加氧酶及胆绿素还原酶，重组成血红素加氧酶系，在体外生理条件下非膜重组的三种酶的混合物能使血红素降解为胆红素1Xα，Sepharose4B柱亲和层析表明，三种酶混合后组成一个非单一性质的酶三元复合物;SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析表明，复合物中的三种酶可以分离，且分子量没发生变化，组成的摩尔比为1∶1∶1，说明三种酶在形成三元复合物时，仍保留每一种酶的性质，以及三种酶各自在胆红素合成过程中的作用。血红素加氧酶与NAOPH-细胞色素C还原酶的混合使血红素降解为专一性的胆绿素1Xα，这里血红素加氧酶提供专一性的结合部位，定点识别并结合血红素的α位，而NAOPH-细胞色素C还原酶使血红素氧化开环，然后再由血红素加氧酶催化断裂后的两端羟化;而催化胆绿素还原成胆红素是酶三元复合物中胆绿素还原酶的作用，其催化部位邻近于前二种酶的活性部位。
血红素加氧酶是参照Yoshinga等的方法从猪脾中分离纯化的，纯化后的活性为6550单位/mg蛋白(1个活力单位定为每小时转化1nmol的胆绿素);NAOPH-Cyt.C还原酶是从猪脾中提取的，根据Yasukochi等的方法，利用2′、5′-AOP-Sepharose-48进行亲和层析，酶的最低活性为62.8单位/mg蛋白(1个活力单位定为每分钟还原1nmol的细胞色素C);胆绿素还原酶是从猪肝中分离纯化的，纯化后的活性为1100单位/mg蛋白(1个单位定为每分钟催化生成1nmol胆红素)。
分离纯化血红素加氧酶系的基本方法见附图
，用该分离纯化方法;每公斤猪肝或脾可获得血红素加氧酶4.54mg，NAOPH-细胞色素C还原酶9.25mg，胆绿素还原酶6.78mg。
血红素降解含成胆红素的过程与诸多因素有关，如温度、保温时间、缓冲液种类，如温度、保温时间、缓冲液种类、pH值及离子强度等，还需要O2和NAOPH，因此在血红素加氧酶重组的混合酶液中加5%的肝糜浆，使其中的过氧化氢酶分解H2O2补充O2，磷酸戊糖途经酶系补充NAOPH。
本发明以动物血液(猪血、牛血、鸡血等)为原料，采用血红素加氧酶系粗酶混合液一步合成胆红素，与国际通用方法比较，生产周期缩短三分之二，成本降低70%左右，收率高达总血量的千分之一，血红素转化率达65%以上，产品纯度高，无对人体有害的异构体，药物有效成份胆红素1Xα含量高达92.00%至95.24%。原料资源广泛，价格低廉，经济效益显著，还为动物血的综合利用开辟了新途径。
权利要求
1.一种以新鲜动物血为原料一步合成胆红素的方法--酶法合成胆红素，其特征在于胆红素的酶促降解合成工艺如下(1)在新鲜动物血中加入8%柠檬酸钠抗凝剂，在温度为5～10℃，速率3000r.p.m条件下离心15′，得到的血红蛋白液以10000r.p.m高速捣碎5′，破碎细胞成血红蛋白浆；(2)在血红蛋白浆中，按新鲜血量的5%加入重组血红素加氧酶系的混合酶液和3倍血红蛋白浆量、PH为7.4的磷酸缓冲液上反应柱，同时在反应柱中加入2%的H2O2和5%葡萄糖液，在37℃温度条件下反应5小时；(3)在经酶解的反应液中加入1N的氢氧化钠溶液，调节PH至11，并煮沸3′；(4)碱解液在5℃温度条件下，以3000r.p.m速率离心15′去除蛋白；(5)在上清液中按1∶1的重量比加入氯仿液，再用2N盐酸调溶液至PH至4.5～5.0，分层，收集氯仿混合液；(6)氯仿混合液经旋转蒸发浓缩后，减压，在50℃温度下回收氯仿得胆红素液；(7)胆红素液用无水乙醇、乙醚洗涤除去杂质得到的胆红素，再在60℃温度中真空干燥为胆红素成品。
2.按权利要求1所述的酶法合成胆红素，其特征在于重组的血红素加氧酶系混合酶液是从新鲜动物的肝、脾制得的血红素加氧酶、胆绿素还原酶和NAOPH-细胞色素C还原酶以1∶1∶1的比例组合，加入pH7.4的磷酸缓冲液配制成50mM的酶液，并加入5%的肝糜浆即成混合酶液。
全文摘要
酶法合成胆红素属于以动物血液为材料使用酶法合成胆红素。酶促降解合成胆红素的工艺是将新鲜动物血离心、细胞破碎成血红蛋白浆后加入一定量的重组血红素加氧酶系混合液在37℃的反应柱中酶解5小时，酶解液加入氢氧化钠碱解，离心去除蛋白，上清液用氯仿萃取后蒸发浓缩，洗涤制成胆红素，用本法合成的胆红素生产周期缩短三分之二，成本降低70％，收率高达总血量的千分之一，血红素转化率达65％以上，产品纯度高，胆红素IXa含量高达92％以上，经济效益显著。
文档编号C12N9/02GK1097026SQ9311147
公开日1995年1月4日 申请日期1993年6月30日 优先权日1993年6月30日
发明者龚兴国, 曾冬云, 易春光, 吴立安, 饶力群 申请人:吉首大学