小麦抗氧化相关基因及其编码蛋白与应用的制作方法

专利名称：小麦抗氧化相关基因及其编码蛋白与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体地，本发明涉及与小麦抗光抑制和光氧化相关的硫氧化还原因子蛋白及其编码序列，包括该基因的克隆、表达模式及应用。
背景技术：
生物体内存在着大量的活性氧类物质，这类物质有两种重要的作用。第一低含量的活性氧可以作为信号分子调控细胞分裂、细胞分化等重要生理过程1 ；第二 大量的活性氧可以造成蛋白、DNA以及膜脂的损害进而造成细胞的死亡2。生物在生命过程中往往很容易产生大量的活性氧，因此，清除过量的活性氧对生物体而言十分重要。Peroxiredoxin (PRX,过氧化物还原因子)作为一类广泛存在的过氧化物酶可以参与各类活性氧的清除。在哺乳动物中，根据PRX中保守半胱氨酸的数目和位置可以把PRX 分为 lCys-PRX，2Cys-PRX 和非典型 2Cys-PRX3 ；植物中则分为 ICys-PRX，2Cys_PRX，PRX Q和 II类PRX4。2Cys_PRX的C端Cys残基参与清除活性氧的过程中可以依次被氧化成次磺酸形式、亚磺酸形式和磺酸形式。当2Cys_PRX的C端Cys残基成为亚磺酸形式的时候，需要 Sulfired0Xin(SRX，硫氧化还原因子)在镁离子和ATP参与下帮助其恢复还原活性5，并且 SRX这种还原作用只特异地对2Cys-PRX进行6’7。目前在动物细胞中已经分离结晶到人类的SRX与2Cys-PRX的复合体，它们形成四聚体之后又进一步聚合成为十聚体形式存在8，并且SRX、2Cys-PRX、二价镁离子、ATP形成一个四聚体帮助ATP攻击2Cys_PRX的亚磺酸形式的C端Cys残基开始第一步催化反应9。植物中对SRX和2Cys_PRX的研究在拟南芥中进行地较为深入7’1Q。拟南芥中 At2Cys-PRXA和At2Cys-PRX B两个蛋白都存在于叶绿体当中，SRX成熟蛋白也定位在叶绿体当中，并且二者之间在存在特异的互相作用。植物的叶绿体是植物体内最主要的活性氧产生源头之一，叶绿体内活性氧的积累可以造成光抑制和光漂白“。在拟南芥atsrx 缺失突变体中，叶绿体光合系统发生光抑制的程度大大增加，同时抗光漂白能力也很大程度的下降。体外的实验证实AtSRX在二价镁离子和ATP的参与下可以还原亚磺酸形式的 At2Cys-PRXA/B ；同时在各种引起活性氧爆发的胁迫条件下AtSRX的表达量都明显增加。因此SRX在叶绿体的光合系统保护方面起着重要的作用12。六倍体普通小麦(小麦，亚基因组组分为AABBDD)是世界上最重要的粮食作物之一，由小麦面粉所制备的各类产品(如面包、馒头、面条等)是广大民众的日常食品。随着世界人口的大幅度增加和面食的广泛推广，小麦的需求量与日俱增。增加小麦的产量中核心的问题是改良小麦的光合作用，即培养高光效的、耐光胁迫性强的、抗逆性强的小麦品种 13O我们研究普通小麦小偃54 (XY54)中TaSRX及其编码基因正是基于这个目的，深入揭示小麦耐光胁迫机制，通过转基因获得耐光胁迫性强和抗逆性强的高光效高产小麦。这对于普通小麦的遗传改良有着极其重要的理论和实际意义
发明内容
本发明人通过比对拟南芥和水稻等的SRX基因的EST序列，用同源克隆的方式从六倍体普通小麦小偃54(XY54)的基因组DNA中克隆到三个全长的TaSRX的部分同源基因， 分别命名为TaSRX-A、TaSRX-B、TaSRX-D，并且克隆到了这三个基因的cDNA全长序列。它们的全基因序列分别为1866bp、1972bp、2101bp ；全长编码框都是465bp ；都编码154个氨基酸的蛋白。三个蛋白都含有植物中SRX特异的FSGCHR酶活中心氨基酸序列；都定位于叶绿体当中，都可以和At2CPRXA/B相互作用。本发明旨在探索SRX同源基因在小麦中的功能，阐明TaSRX是否参与小麦叶绿体光合系统的保护，是否参与小麦抗光抑制和光氧化的过程， 是否在小麦中有功能分化，以及在不同遗传背景下功能是否有强弱之分。首先，我们研究了 TaSRX基因在小麦不同器官中的转录水平表达模式，并认真分析了每个拷贝特异的表达模式，发现它们主要表达在幼叶和旗叶；利用病毒介导的小麦内源基因沉默技术研究对比六倍体普通小麦小偃54(XY54)和京411(J411)叶片光合系统在 SRX基因部分的情况下发生光抑制程度的变化，分析基因功能的同时比较基因功能在不同遗传背景下的变化；利用病毒介导外源基因过表达技术在烟草叶片中分别过表达三个拷贝，分析三个拷贝的抗氧化功能强弱分化以及对烟草生物量有无影响。我们建立起一套独特的分析小麦重要基因功能分析的办法首先是先得到基因， 可以明确而有针对性地对该基因开展研究；其次是利用病毒介导的转录后沉默和过表达技术分析基因功能和分化，而无需进行图位克隆。本发明揭示了小麦TaSRX基因的抗氧化功能，保护光合系统免除光抑制和光氧化的功能及其分化；证实了该基因在不同的遗传背景下发挥作用的程度不同；同时该基因的表达可以增加植物的生物量。这些表明TaSRX基因可被用于培养高光效耐逆小麦的分子改良，前景广阔。具体内容如下1. 一种小麦抗氧化相关基因TaSRX-A，其包含下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；编码序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和与SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。2. 一种小麦抗氧化相关基因TaSRX-B，其包含下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID N0. 2所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID N0. 8所示的核苷酸序列；编码序列表中SEQ ID N0. 5所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和与SEQ ID N0. 2或SEQ ID N0. 8所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。3. 一种小麦抗氧化相关基因TaSRX-D，其包含下列核苷酸序列之一序列表中SEQ ID N0. 3所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID N0. 9所示的核苷酸序列；编码序列表中SEQ ID N0. 6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和与SEQ ID N0. 3或SEQ ID N0. 9所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。4.小麦抗氧化相关蛋白TaSRX-A，其选自以上1中的小麦抗氧化相关基因TaSRX-A所编码的蛋白质；或在SEQ ID NO. 4的氨基酸序列经过取代、缺少或添加一个或多个氨基酸且具有与 SEQ ID NO. 4的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID NO. 4衍生的氨基酸序列。5.小麦抗氧化相关蛋白TaSRX-B，其选自以上2中的小麦抗氧化相关基因TaSRX-B所编码的蛋白质；或在SEQ ID NO. 5的氨基酸序列经过取代、缺少或添加一个或多个氨基酸且具有与 SEQ ID NO. 5的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 5衍生的氨基酸序列。6.小麦抗氧化相关蛋白TaSRX-D，其选自以上3中的小麦抗氧化相关基因TaSRX-D所编码的蛋白质；或在SEQ ID N0. 6的氨基酸序列经过取代、缺少或添加一个或多个氨基酸且具有与 SEQ ID N0. 6的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 6衍生的氨基酸序列。7.含有以上1-3中任一项所述基因的表达载体。8.以上7中所述的表达载体，其中所述载体是双元农杆菌载体。9.含有以上7或8中所述的表达载体的细胞系。10.以上1-3中任一项所述的基因在调节植物抗氧化功能或在保护光合系统免除光抑制和光氧化功能中的应用。11.以上10中所述的应用，其中所述植物是小麦，优选是六倍体普通小麦，如小偃 54 (XY54)、京411 (J411)、Langdon、乌拉尔图小麦和山羊草。12. 一种分析小麦基因功能的方法，包括得到所述基因；和利用病毒介导的内源基因沉默系统或外源基因过表达系统分析基因功能和分化。13.以上12中所述的方法，其中所述小麦是六倍体普通小麦，如小偃54 (XY54)、京 411 (J411)、Langdon、乌拉尔图小麦和山羊草。14.以上12或13中所述的方法，其中所述病毒介导的内源基因沉默系统是大麦条纹花叶病毒(Barly Stripe Mosaic Virus, BSMV)介导的小麦内源基因沉默系统。15.以上12或13中所述的方法，其中所述病毒介导的外源基因过表达系统是豌豆早褐病毒(PEBV)介导的外源基因过表达系统。


图1 :TaSRX_A、TaSRX-B, TaSRX-D全长基因序列和拟南芥AtSRX、水稻OsSRX的结构比对。箭头所指的第2个内含子是物种之间长度相对变化最大的内含子。图2 =TaSRX-A(图中以A表示)、TaSRX-B(图中以B表示)、TaSRX-D(图中以D表示)完整编码框cDNA的比对。箭头所指的是cDNA第178位的碱基，TaSRX-A中为A，TaSRX-D 中为T。图3 =DNAstar软件预测的TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D蛋白氨基酸序列与其它物种SRX蛋白全序列的比对。方框和箭头指示所有SRX蛋白都含有的酶活中心“FSGCHR”。图4 六倍体小麦中TaSRX基因的拷贝数鉴定。用带有荧光标记的跨第二个内含子的保守引物扩增六倍体小麦及其亚基因组供体材料基因组DNA，对PCR产物进行毛细电泳分析。图5 :TaSRX-A/B/D-GFP融合蛋白的亚细胞定位。图5_1是转基因载体示意图；图 5-2是对表达TaSRX-A/B/D-GFP融合蛋白的转基因拟南芥(互补atsrx突变体7的株系) 的叶片进行Confocal活体观察的结果，第1列是GFP荧光，第2列是叶绿素荧光，第3列是前两列荧光的叠加。从上到下依次是野生型拟南芥(Columbia，WT)、GFP互补atsrx拟南芥株系和TaSRX-A/B/D-GFP互补atsrx拟南芥株系的结果。图6 六倍体普通小麦小偃54不同器官中TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D的转录表达模式。用实时PCR技术检测，分别是用跨第二个内含子的保守引物和TaSRX-A、TaSRX-B、 TaSRX-D的特异引物进行扩增。图7 六倍体普通小麦小偃54(XY54)和京411 (J411)中病毒介导的TaSRX基因沉默效果以及光合生理指标，图中WT代表未接种病毒的小麦，GFP代表接种了带有GFP标签病毒的小麦，Srx代表接种了带有SRX基因片段病毒的小麦。图7-1 实时PCR分析小偃54 和京411中BSMV介导的TaSRX基因沉默效果，同样分别用图6中的4对引物进行扩增；图 7-2 小偃54和京411叶片在强光和强光低温胁迫条件下Fv/Fm的变化，Fv/Fm是指植物叶片光合系统II的最大光化学效率；图7-3 小偃54和京411叶片在强光和强光低温胁迫条件下NPQ的变化(非光化学耗散)；图7-4 小偃54和京411强光低温胁迫条件下净光合速率(Pn)的变化。图8 烟草中病毒介导的TaSRX基因过表达实验。图8-1 烟草中PEBV介导的TaSRX 基因过表达状况；图8-2 烟草地上部分生物量的测量；图8-3 烟草叶片对Paraquat造成的光氧化的耐受程度；图8-4 =Paraquat处理前后烟草叶片的叶绿素相对含量；图8_5 Paraquat处理前后烟草叶片的过氧化氢的相对含量；图8_6 烟草叶片在强光和强光低温胁迫条件下Fv/Fm的变化；图8-7 烟草叶片在强光和强光低温胁迫条件下NPQ的变化。图9 载体结构示意图，其中9-1是pJIT163-TaSRX_GFP中间载体结构示意图；图 9-2是pCAMBIA-1300载体结构示意图。序列说明SEQ ID NO. 1SEQ ID NO. 2SEQ ID NO. 3SEQ ID NO. 4SEQ ID NO. 5SEQ ID NO. 6SEQ ID NO. 7SEQ ID NO. 8SEQ ID NO. 9
具体实施例方式下面通过实施例详细描述本发明。本领域的普通技术人员可以理解，下述实施例仅是用于举例说明的目的，并非限制本发明。本发明的保护范围由后附的权利要求所界定。实施例1 =TaSRX基因的同源克隆以及基因结构分析
= TaSRX-A基因的全长序列； = TaSRX-B基因的全长序列； = TaSRX-D基因的全长序列； = TaSRX-A的蛋白序列； = TaSRX-B的蛋白序列； = TaSRX-D的蛋白序列； = TaSRX-A基因的编码序列； = TaSRX-B基因的编码序列；和 = TaSRX-D基因的编码序列。
通过NCBI-Blastn搜索到SRX基因所有的EST序列，通过比对拼接得到三类在六倍体小麦(亚基因组组分为AABBDD)中发现的SRX基因全长EST序列。在ATG和TGA处设计保守引物同时克隆这3个拷贝，依次进行PCR扩增，回收目的片段，T-A连接，转化细菌感受态，37°C培养，菌落PCR鉴定得到阳性克隆，阳性质粒提取，最后进行质粒酶切鉴定和测序得到三个拷贝的基因组全长序列。它们与拟南芥和水稻SRX基因(即AtSRX和OsSRX) 比对如附图1所示。具体步骤如下所述所用引物为5，-ACGAATGGCGTCGACCTCGAGCTT-3，和 5，-CATCGCTAACCACCAATTCATCG CATAT-3，。PCR扩增反应条件95°C预变性5min ;94°C 40s,68°C 2. 5min，两步法33个循环； 68°C 7min。反应体系 50 μ 1 :10XPCR 反应缓冲液 5 μ l，LA_Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1， IOOng小偃54(ΧΥ54)基因组DNA(XY54种子来自中国科学院遗传发育所李振声院士实验室14)，DNA来自幼苗期的叶片，提取方法如下段描述)，2. 5mmol dNTP 4μ1，5μπι01引物各Ιμ ，加灭菌双蒸水至50μ1。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，用凝胶提取试剂盒(Gel Extraction KIT，购自鼎国公司)从琼脂糖凝胶上纯化目标TaSRXDNA片段(方法参照试剂盒说明书)，用Eppendorf公司BioPhotometer测定浓度后用于酶切、连接或存_20°C 备用。纯化的TaSRX DNA片段与pGEM-T Easy载体(Promega公司，氨苄霉素抗性)连接 (T4-DNAligase, Promega公司，按照试剂盒说明书操作)，热激转化(42°C 90S)入大肠杆菌 DHlOB(Invitrogen公司)。从得到的克隆转化子中用菌落PCR(引物为上述扩增引物)鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒(小提质粒试剂盒，北京博大泰克公司，方法参照试剂盒说明书进行)。小麦基因组DNA提取方法将新鲜的小麦幼苗经液氮冷冻后充分研磨， 取IOOmg粉末于灭菌2mL Eppendorf管中；加入ImL CTAB提取缓冲液{1. 3 % CTAB (HexadecylTrimethyl Ammonium Bromide,十六烷基三甲基溴化铵，购自 Amresco 公司)，133mmol/LTris-HCl ρΗ8· 0(Tris 购自 Amresco 公司，HCl 购自北京化工厂)，13mmol/ LEDTA(购自 Amresco 公司)，0.93mol/L NaCl (购自北京化工厂)，0. 66% PVP 3600 (购自 Amresco公司)，0. 18mol/L β -巯基乙醇(购自北京鼎国生物技术有限责任公司)}，混勻； 65°C温浴1. 5h，其间不时混合样品，以充分提取；待样品冷却至室温，加入ImL氯仿/异戊醇(24 1，均购自北京化工厂)进行抽提，轻轻颠倒混勻Ihr ；4°C，12000rpm离心15min ； 将上清液转移至一新的离心管中，重复氯仿/异戊醇抽提一次；吸取上清液至一新的离心管中，加入3yL RNase A(10mg/ml，购自Sigma公司)，室温下在摇床上消化45min ；缓慢加入420 μ L异丙醇(购自北京化工厂)，轻轻上下摇晃，直到出现白色DNA沉淀；用枪头挑出 DNA，用ImL Wash I溶液(76%乙醇-购自北京化工厂，200mM NaAc-购自北京化工厂)浸泡洗涤15min。轻柔离心，弃上清；吸干残余液体，DNA沉淀室温吹干至透明，加入100 μ L TE溶液 (Tris-EDTA溶液，ρΗ8. 0)；待DNA充分溶解后，测定DNA浓度和质量；经适当稀释后直接用于PCR反应或储存于_70°C冰箱备用。如附图1所示该基因结构在不同物种相当保守，包含了 5个外显子和4个内含子，其中第二个内含子在各个物种之间长度变化幅度很大。实施例2 =TaSRX基因cDNA序列的克隆及蛋白序列预测和比对
用实施例1中相同的引物克隆XY54TaSRX的cDNA。PCR扩增反应条件95°C预变性 5min;94°C 40s, 68°C lmin，两步法 33 个循环；68°C 7min。反应体系 50 μ 1 :10XPCR 反应缓冲液 5 μ 1，LA-Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1，IOOng 小偃 54cDNA, 2. 5mmoIdNTP 4 μ 1， 5 μ mo 1引物各1 μ 1，加灭菌双蒸水至50 μ 1。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，纯化目标TaSRX cDNA片段，Eppendorf公司BioPhotometer测定浓度后用于酶切、连接或存_20°C备用。纯化的TaSRX cDNA片段与pGEM_T Easy载体连接，热激转化入大肠杆菌DH10B。菌落PCR(引物为上述扩增引物)鉴定阳性克隆，提取阳性克隆质粒。具体的分子克隆技术说明如实施例1中所示。其中，小偃54RNA提取如下实验所用材料的总RNA提取采用RNAeasy PlantMini Kit(Qiagen，Valencia, CA)试剂盒或 TRIZOL (Invitrogen 公司)提取。模板 cDNA 第一链合成在灭菌的Eppendorf管中按顺序加入6yg上述总RNA和3μ 1 oligo(dT) ；70°C水浴 10分钟后，迅速置于冰上冷却；按以下顺序加入以下溶液5X逆转录缓冲液5μ1DTT6 μ 1dNTPs6 μ 1RNasin1 μ 1加水补足58 μ 137°C温育2分钟；加入2 μ 1 M-MLV逆转录酶，混勻，37°C反应1_2小时；反应结束后，将Eppendorf管取出，70°C处理15分钟灭活逆转录酶；反应合成的cDNA第一链可用作 PCR反应的模板。其中使用的试剂如下M-MLV 逆转录酶和0. IM DTT (Gibco) ；dNTPs (IOmM each)和 oligo(dT)18(500 y g/ml) (Sangon) ;RNasin(40U/ml，Takara) ；5X 逆转录缓冲液 (Takara )。如附图2和3中所示TaSRX-A、TaSRX-B、TaSRX-D的cDNA (序列分别表示为SEQ ID N0. 1、SEQ ID NO. 2 和 SEQ ID NO. 3)和蛋白(序列分别表示为 SEQ ID N0. 4、SEQ ID NO. 5 和SEQ ID NO. 6)序列(DNAstar软件预测)的比对结果显示它们之间有98%的相似性，长度都是465bp，编码154个氨基酸的蛋白。三个拷贝蛋白序列的物种分析比对结果表明它们具有典型的“FSGCHR”的酶活中心；TaSRX-A、TaSRX-D除了信号肽的微小差别之外，成熟蛋白区域只有1个氨基酸的差异(第60位，TaSRX-A为Serine，TaSRX-D为Cystine)，而这个氨基酸的差异是由二者的 cDNA 第 178 位的一个 SNP (Single Nucleotide Polymorphysim, 单核苷酸多态性)A-T造成。实施例3 =TaSRX基因拷贝数的确定-荧光标记的DNA片段分析技术采用荧光标记的跨第2个内含子的保守引物(仅在上游引物的5’端标记D4 荧光标记，Takara)扩增小偃54(亚基因组组分为AABBDD)、京411 (亚基因组组分为 AABBDD,种子来自中国科学院遗传发育所李振声院士实验室14，DNA来自幼苗期的叶片)、 Langdon (亚基因组组分为AABB，种子购自美国的Graingene)、乌拉尔图小麦(亚基因组组分为AA，种子购自中国农科院作物科学研究所)、山羊草(亚基因组组分为DD，种子购自中国农科院作物科学研究所)基因组DNA(提取方法参考实施例1)，得到的PCR片段经琼脂糖凝胶电泳检测证实目标带存在之后进行变性(95°C，10min)，用CEQ TM 8000 GeXP System—Genetics Analysis System(美国贝克曼公司)进行毛细电泳，分辨率为lbp。电泳条件为4. 8千伏，变性时间120秒，注射时间15秒，分离时间50分钟。所用保守引物为 5，-CTCATGGACAGCATCCGTGT-3，(带有 5，荧光标记)，5，-GGTTGATTCTGGGATATGGCA-3，；产物大小为TaSRX-A-403bp、TaSRX_B_508bp、TaSRX_D_643bp ；PCR 扩增反应条件95°C预变性 5min ；94°C 35s, 56°C 35s，72°C 40s，33 个循环；72°C IOmin ；反应体系 50 μ 1 :10XPCR 反应缓冲液 5 μ l(Takara 公司)，LA-Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1，IOOng 基因组 DNA，2. 5mmol dNTP4y l，5ymol引物各1 μ 1，加灭菌双蒸水至50 μ 1。如附图4所示片段分析的结果对应于引物扩增的每个条带只有一个峰，表明没有其它的拷贝存在。因此证实六倍体普通小麦中只有TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D这三个拷贝。山羊草中存在两种类型的D拷贝类型，其中第一种类型与六倍体中TaSRX-D —致，而第二种则比TaSRX-D少了一段内含子，这段内含子正是TaSRX-D较TaSRX-B多出的内含子。现已证实这段内含子是来自叶绿体基因组的一段序列实施例4 =TaSRX-A, TaSRX-B, TaSRX-D的成熟蛋白定位于叶绿体为了得到最确切的TaSRX蛋白亚细胞定位结果，我们用TaSRX_A、TaSRX-B, TaSRX-D转拟南芥atsrx的突变体植株7 (来自SALK Institute)，得到纯合的拟南芥转基因互补株系。转基因载体如附图5-1所示，GFP连接在TaSRX的C端。用这些转基因植株的叶片观察到TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D和GFP融合蛋白的荧光与叶绿素的荧光重叠，表明它们都定位在叶绿体当中，结果如附图5-2所示。具体方法如下所述我们采用PJIT163-GFP (氨苄霉素抗性，本实验室构建15)和pCAMBIA_1300 (卡那霉素抗性)载体(购自国际农业分子生物学应用中心)构建转化拟南芥的双元载体。先构建 pJIT163-TaSRX-GFP 中间载体引物是 5，-AC AAGCTTATGGCGTCGACGTCGAGCTTGGATT-3，( 带有 Hind III 接头)和 5，-AC GGATCCTCGCATATGGTGCCGCAGTG-3，(带有 BamH I 接头)； PCR扩增实施例2中TaSRX的全长cDNA质粒，产物回收纯化，使用Hind III和BamH I进行酶切再纯化，连接同样由Hind III和BamH I酶切之后回收纯化的pJIT163_GFP载体，热激转化细菌(大肠杆菌DH10B，Irwitrogen公司)，经菌落PCR鉴定阳性克隆，提质粒得到 pJIT163-TaSRX A/B/D-GFP中间载体，测序无误之后进行下一步。再构建1300_TaSRX_GFP 双元载体作为拟南芥转化的载体用Kpn I和Xho I酶切pJIT163-TaSRX A/B/D-GFP中间载体，Kpn I和Sal I酶切pCAMBIA_1300载体，回收纯化相应的片段(分别包含35S Promotor-TaSRX-GFP 和 pCAMBIA-1300 的酶切片段)，连接构建 1300-TaSRX A/B/D-GFP, 热激转化细菌(大肠杆菌DH10B)，菌落PCR鉴定阳性克隆，提质粒得到1300-TaSRX Α/Β/ D-GFP载体。具体的分子克隆技术如实施例1中所示。pJIT163-TaSRX-GFP中间载体和 pCAMBIA-1300的结构示意图分别如图9_1和9_2所示。农杆菌感受态制备挑取农杆菌(Agrobacterium tumefaciens GV3101(利福平 Rif 抗性，50mg/L)GV3101冻存菌(菌株购自英国John Innes Center)，在LB (含50 μ g/ml利福平) 平皿划线28°C培养1-2天，将生长良好的单菌落接种于3-5ml LB (含50 μ g/ml利福平， Sigma)液体培养基中，28°C振荡培养过夜；吸出Iml菌液接种于IOOml LB (含50 μ g/ml禾Ij 福平)液体培养基，28°C振荡培养6-8小时至0D_为0. 5左右，将菌液转移至50ml离心管， 放置冰上30分钟，然后离心收集菌体(5，OOOrpm, 10分钟，4°C )；弃去上清，加入Iml冰冷的0. 15M氯化钠溶液轻轻悬浮菌体，再加入约10ml，使菌体分散均勻，冰上放置30分钟，离心收集菌体(5，OOOrpm, 10分钟，4°C )；弃去上清，加入Iml冰冷的20mM氯化钠溶液悬浮菌体，将制好的感受态细胞以0. 2ml/管分装，在液氮中速冻1分钟后保存在_70°C备用。质粒转化农杆菌将1 μ g以上制备的质粒，即1300-TaSRX A/B/D-GFP载体加入含0. 2ml的农杆菌感受态的Eppendorf管中，冰上放置30分钟；将含有该质粒和农杆菌感受态的Eppendorf管放入液氮速冻1分钟，然后再37°C温育3分钟；加入Iml LB液体培养基，28°C震荡培养3-5小时；5, OOOrpm离心1分钟，弃去上清，加入200 μ 1 LB液体培 养基， 重悬沉淀；取200 μ 1重悬液(即转化产物)均勻地涂于含50 μ g/ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素的LB平板上，28°C培养2-3天；挑取适量的转化菌斑PCR鉴定无误后摇菌转化拟南芥植株。农杆菌转化拟南芥将鉴定无误的农杆菌接种于5ml LB液体培养基中(含50μ g/ ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素，卡那霉素购自Sigma)，28°C震荡培养过夜；次日以1 100 的比例转移至400ml LB液体培养基中(含50 μ g/ml利福平和50 μ g/ml卡那霉素)，28°C 震荡培养至OD6tltl为0. 8左右；离心收集菌体，用400ml转化缓冲液{0. 5 XMS盐(Murashige & Shoog Medium，购自Duchefa Biochemia)，5%蔗糖(购自北京化工厂)，调节pH 5. 7后加入 0·44μΜ benzylamine purine (苯胺嘌呤，购自 Sigma)，0· 02% Silwet (表面活性剂， 购自Ameresco)}悬浮该农杆菌；抽真空转化拟南芥植株，即将剪枝后4-6天的植株倒置于含其中悬浮有以上农杆菌的转化缓冲液的玻璃瓶中，抽真空，维持40秒；取下植株，避光保湿侧放24小时，然后将种植盆直立，按正常的方法培育植株至结实，收获成熟种子。拟南芥转基因纯合株系的筛选将干燥一周后的种子播种于含50μ g/ml潮霉素(hygromycin,购自Sigma)和50 μ g/ml头孢霉素(购自Sigma)的0. 5XMS培养基上， 每皿500粒左右；4°C春化2-3天，23°C培养，只有含外源片段的转基因植株才能在选择培养基上生长；长出的植株生长到6片真叶时，移至种植盆中生长，待成熟后分单株收获种子(Tl代)；收取的Tl代种子分单株在含50μ g/ml潮霉素的选择培养基上撒播，将发生 3 1分离的单株系的存活苗移栽至种植盆中生长，再分单株收获种子(T2代)；收取的 T2代种子分单株在含50 μ g/ml潮霉素的选择培养基上撒播，不发生任何分离的株系可以分单株收取种子(T3代)。T3代种子即为纯合单拷贝转基因株系，可以进行繁种扩增以便进行亚细胞定位和后期的生物学实验。拟南芥正常培养条件23°C ；光照强度100 μ mol photons · m_2 · s—1 (单位面积单位时间内通过的光量子摩尔数)；16小时光照，8小时黑暗。实施例5 =TaSRX多表达在小麦的叶片中采集小偃54的各类器官幼叶、旗叶、根、茎、幼穗、花、种子，并提取它们的总RNA，反转录成为cDNA (方法参看实施例2)。实时PCR16分析TaSRX总的表达模式和TaSRX A/B/D拷贝特异的表达模式。如附图6中所示=TaSRX多表达在幼叶和旗叶中，TaSRX A多表达在旗叶中，TaSRX B多表达在幼叶和种子中，TaSRX D多表达在旗叶中。分析TaSRX所用引物为实施例3中的保守引物；分析TaSRX A所用特异引物17是 5，-GCTTGGATTTGGGAAAGATCAGT-3，和 5，-TCCGAGTCACTCAATGCGTAG-3，(PCR 扩增反应条件 95°C预变性 3min ;94°C 20s, 58. 5°C 20s, 72°C 20s，40 个循环.)；分析 TaSRX B 所用特异引物是5，-ACCTCGAGCTTGGAGTTGAGG-3，和 5，-TTCTTCTCCGAGTCACTCAGAGG-3’(PCR 扩增反应条件95°C预变性 3min ;94°C 20s, 56°C 20s, 72°C 20s，40 个循环.)；分析 TaSRX D 所用特异引物是5，-TCGAGCTTGGATTTGGGAAAGATCGTG-3，和 5，-CCTAAGCGCTGGTGAGCCTCACAT-3， (PCR扩增反应条件95°C预变性 3min ;94°C 20s, 66°C 20s, 72°C 20s，40 个循环.)。PCR 反应体系 50 μ 1 10 X PCR 反应缓冲液 5 μ 1 (Takara 公司)，LA-Taq 酶(Takara 公司)0. 5 μ 1， IOOng基因组DNA，2. 5讓ol dNTP4 μ l,5ymol引物各1μ 1，加灭菌双蒸水至50 μ L· 实施例6 六倍体小麦中TaSRX保护叶绿体光合系统的功能为了研究小麦中TaSRX基因的功能，我们利用BSMV (Barly Stripe Mosaic Virus) 介导的小麦内源基因沉默系统18’19’2°下调了小偃54和京411中TaSRX的表达。研究了在 TaSRX基因部分沉默的情况下，小偃54和京411在正常生长条件和胁迫条件下的光合系统效率变化。如附图7所示沉默该基因造成小偃54和京411在胁迫条件下的光合系统效率 (Fv/Fm)大大下降、光抑制程度加强、非光化学耗散(NPQ)增多和净光合速率(Pn)的下降。 这表明TaSRX在六倍体小麦种发挥了抗氧化和保护光合系统免受光抑制的作用，同时这种作用和小麦叶绿体内部的非光化学耗散也是紧密相关的。京411缺失该基因表现出比小偃 54更加敏感的表型，表明TaSRX基因已经在不同的遗传背景下发挥了不同程度的功能。具体方法如下所述构建BSMV γ -TaSRX 载体所用引物为 5，-ATA GCTAGCATGGCGTCGACCTCGAGCT-3， 禾口 5，-ATT GCTAGCGGCCTTTCTTCTCCGAGTCA-3，(2 条引物都包含 Nhe I 酶切接头)；以实施例2中cDNA质粒为模版扩增，回收纯化PCR产物，使用Nhe I酶切PCR回收片段和BSMV Y，回收目的片段并连接，转化细菌(DH10B，Invitrogen公司)，菌落PCR鉴定阳性克隆，提质粒得到目的载体并测序。具体的分子克隆技术如实施例1中所示。载体图谱和病毒介导的小麦内源基因沉默(VIGS，Virus Induced Gene Silencing)操作流程详见参考文献18。病毒载体接种小麦叶片后10天提取小麦第3片叶子的RNA并进行cDNA合成(方法如实施例2中所示)，实时PCR16分析TaSRX总的沉默效果(相对于未接种的小麦对照和接种带有GFP的病毒的小麦)和TaSRX A/B/D拷贝特异的沉默效果(所用引物和方法与实施例5中一致)。我们发现接种含TaSRX病毒的小麦TaSRX-RNA被沉默到对照TaSRX-RNA 的5-40%之间，符合功能试验的要求。Fv/Fm和NPQ的检测方法参见文献16和21 ；净光合速率的检测21按照生产商的说明，使用美国LI-COR公司的Li-6400便携式光合测定仪。强光处理条件1200μπιΟ1 photons ·πΓ2 · s—1，25 °C，2h ；强光低温处理条件 1200 μ mol photons · m2 · s-1，6°C, 2h。实施例7 : TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D 的功能分化在六倍体普通小麦当中验证TaSRX基因具有保护光合系统的功能，但是由于小麦的遗传背景的复杂性以及TaSRX基因A、B、D拷贝之间的高度保守性(目前还不可能在小麦中单独沉默单个SRX拷贝)，在小麦中研究该基因的功能分化遇到了瓶颈，因此我们又进一步在烟草中分别研究TaSRX-A、TaSRX-B, TaSRX-D的抗氧化功能和分化。如附图8所示，烟草中PEBV(豌豆早褐病毒)介导的外源基因过表达20实验表明抗氧化和保护光合系统功能TaSRX-A > TaSRX-B > TaSRX_D。附图8_1表明这个病毒介导的过表达系统是有效的，TaSRX-GFP的免疫印迹检测表明蛋白不但表达了，而且表达水平比较一致，所用一抗为抗-GFP，所用二抗为抗-小鼠-AP酶标。附图8-2 过表达TaSRX-A的烟草表现出生物量增加。附图8-3、8-4和8-5表明过表达TaSRX-A的烟草叶片在正常生长条件下叶绿素增加；在paraquat光漂白耐受实验中，过表达TaSRX-A的烟草叶片抗光氧化漂白能力最强(维持了最大的叶绿素含量)，同时过氧化氢含量最低。如附图8-6和8-7所示在引发光抑制的胁迫实验中，过表达TaSRX-A的烟草叶片维持了最大的光合系统效率， 同时具有最小程度的非光化学耗散；过表达TaSRX-B的烟草叶片次之；过表达TaSRX-D的烟草叶片发生光抑制的程度接近GFP对照，光合效率远远低于表达TaSRX-A的叶片，同时非光化学耗散最大。TaSRX A和D的cDNA 178bp处的SNP (附图2)互相突变之后产生TaSRX Am和 TaSRX Dm,TaSRX Dm 即为 TaSRX A,TaSRX Am 即为 TaSRX D。如附图 8 中所示TaSRX_Am 的功能接近TaSRX-D，TaSRX-Dm的功能接近TaSRX_A。TaSRX-A和TaSRX-D功能差异源于蛋白第60位的一个氨基酸，TaSRX-A中为丝氨酸(Ser)，TaSRX-D中为半胱氨酸(Cys)，而交互突变之后发生了功能的互变，这充分说明了这个SNP对于TaSRX-A强大的抗氧化功能的重要性。烟草中PEBV(豌豆早褐病毒)介导的外源基因过表达体系如下1、载体构建PEBV-pCACE2-TaSRX_GFP (具体的载体图谱酶切位点参考文献22)。所用引物为5，-AT CCATGG CGTCGACCTCGAGCTT-3，，5，-TACCATGG CTCGCATATGGTGCCGCAGT-3，(2条引物都带有Nco I酶切位点)；PCR扩增反应条件95°C 预变性 5min;94°C 35s, 58 °C 35s, 72 °C 30s，30 个循环；72 °C IOmin ；反应体系 50 μ 1 10 X PCR反应缓冲液5 μ 1，LA-Taq酶(Takara公司)0. 5 μ 1，1 μ 1实施例2中的cDNA质粒， 2. 5mmol dNTP 4 μ 1，5 μ mol引物各1 μ 1，加灭菌双蒸水至50 μ 1。PCR产物目的条带回收纯化，Nco I酶切基因片段和载体PEBV-pCACE2-GFP载体(载体来自丹麦农业科学院)，回收连接基因和载体，转化大肠杆菌DH10B，鉴定克隆阳性克隆，提质粒。具体的分子克隆技术如实施例1中所示。2、经Nco I酶切测序验证的质粒转化农杆菌GV3101(菌株购自英国John Innes Center)，同时分别用pCAPEl和pCAPE2-GFP、pCAPE2_PDS (载体均购自丹麦农业科学院)转化GV3101 (转化方法参见实施例4)。3、烟草准备25°C培养间内，16小时光照，8小时黑暗，蛭石中生长的本氏烟草苗 (烟草种子购自中国农业大学)，长到5-6片展开叶时用于农杆菌注射。4、烟草注射DpCAPEl及pCAPE2_GFP、pCAPE2_PDS转GV3101后鉴定无误，挑取转化成功的克隆划线 28 °C 培养过夜(LB 培养基，50 μ g/ml Rif(Sigma)，50 μ g/ml Kana(Sigma)；2)挑取上述过夜菌接种到5ml LB (50 μ g/ml Rif，50 μ g/ml Kana)中28°C培养过夜；3)将上述过夜的菌液转接到50ml LB (IOmM MES (Ameresco)+20 μ M乙酰丁香酮 (Sigma) +50 μ g/ml Kana)中，28°C培养过夜；4)离心收集上述菌液，然后重悬在LB(10mM MgC12+10mM MES+200 μ M乙酰丁香酮)中，调0D600 = 2. 0，在室温下静置3小时；5)按pCAPEl pCAPE2 = 1 1注射烟草，注射时要注射近轴端的嫩叶；6)两周后观察表型，进行蛋白检测，之后进行各种生理实验。
参考t献
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权利要求
1.一种小麦抗氧化相关基因TaSRX-A，其包含下列核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO. 1所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列； 编码序列表中SEQ ID NO. 4所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和与SEQ ID NO. 1或SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
2.一种小麦抗氧化相关基因TaSRX-B，其包含下列核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列； 编码序列表中SEQ ID NO. 5所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和与SEQ ID NO. 2或SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
3.一种小麦抗氧化相关基因TaSRX-D，其包含下列核苷酸序列之一 序列表中SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列；序列表中SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列； 编码序列表中SEQ ID NO. 6所示的氨基酸序列的核苷酸序列；和与SEQ ID NO. 3或SEQ ID NO. 9所示的核苷酸序列具有90%以上同一性且编码相同功能蛋白质的核苷酸序列。
4.小麦抗氧化相关蛋白TaSRX-A，其选自权利要求1中的小麦抗氧化相关基因TaSRX-A所编码的蛋白质；或在SEQ ID N0. 4的氨基酸序列经过取代、缺少或添加一个或多个氨基酸且具有与SEQ ID N0. 4的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 4衍生的氨基酸序列。
5.小麦抗氧化相关蛋白TaSRX-B，其选自权利要求2中的小麦抗氧化相关基因TaSRX-B所编码的蛋白质；或在SEQ ID N0. 5的氨基酸序列经过取代、缺少或添加一个或多个氨基酸且具有与SEQ ID N0. 5的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 5衍生的氨基酸序列。
6.小麦抗氧化相关蛋白TaSRX-D，其选自权利要求3中的小麦抗氧化相关基因TaSRX-D所编码的蛋白质；或在SEQ ID N0. 6的氨基酸序列经过取代、缺少或添加一个或多个氨基酸且具有与SEQ ID N0. 6的氨基酸序列相同功能的由SEQ ID N0. 6衍生的氨基酸序列。
7.含有权利要求1-3中任一项所述基因的表达载体。
8.权利要求7中所述的表达载体，其中所述载体是双元农杆菌载体。
9.含有权利要求7或8中所述的表达载体的细胞系。
10.权利要求1-3中任一项所述的基因在调节植物抗氧化功能或在保护光合系统免除光抑制和光氧化功能中的应用。
11.权利要求10中所述的应用，其中所述植物是小麦，优选是六倍体普通小麦，如小偃 54 (XY54)、京411 (J411)、Langdon、乌拉尔图小麦和山羊草。
12.—种分析小麦基因功能的方法，包括得到所述基因；和利用病毒介导的内源基因沉默系统或外源基因过表达系统分析基因功能和分化。
13.权利要求12中所述的方法，其中所述小麦是六倍体普通小麦，如小偃54(XY54)、京 411 (J411)、Langdon、乌拉尔图小麦和山羊草。
14.权利要求12或13中所述的方法，其中所述病毒介导的内源基因沉默系统是大麦条纹花叶病毒(Barly Stripe Mosaic Virus, BSMV)介导的小麦内源基因沉默系
15.权利要求12或13中所述的方法，其中所述病毒介导的外源基因过表达系统是豌豆早褐病毒(Pea Early Browning Virus, PEBV)介导的外源基因过表达系统。
全文摘要
本发明公开了小麦抗氧化相关基因TaSRX-A、TaSRX-B和TaSRX-D及其编码蛋白与应用。本发明还公开了所述基因及其编码蛋白在调节植物抗氧化功能或在保护光合系统免除光抑制和光氧化功能中的应用。该基因在光胁迫条件下能起到清除活性氧、保护光合系统，使植物的抗光抑制和抗光氧化能力增强，进而提高植物的生物量。本发明的基因及其编码蛋白对于普通小麦耐光胁迫机制的研究具有重要的理论意义，对于提高普通小麦和其它重要农作物的产量具有重要的理论以及实际意义，应用前景广阔。
文档编号C12N15/82GK102220346SQ20101014760
公开日2011年10月19日 申请日期2010年4月14日 优先权日2010年4月14日
发明者刘昕, 张坤普, 王燃, 王道文, 秦焕菊 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所