专利名称：检测常见高危型人乳头瘤病毒的方法及试剂盒的制作方法
技术领域：
本发 明涉及检测临床样品中常见高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV，High-RiskHuman PappillomavirudDNA的方法，特别是涉及使用实时聚合酶链反应(PCR)方法检测HPV。该方法使用分子信标荧光探针技术，能特异且灵敏地检测出临床样品中13种常见的高危型人乳头瘤病毒DNA。本发明还进一步涉及用于该临床检测的试剂盒。
背景技术：
宫颈癌(CC)是女性最常见的恶性肿瘤之一，在女性人群中，其致死率仅次于乳腺癌。据估计，全球每年约新增病例大约473，000，每年死于宫颈癌的人数可高达253，500，约 85%发生在发展中国家(http://www.nccc-online.org/)。我国每年新增病例13. 15万， 约3. 5万人死于宫颈癌。近年来，随着环境污染和社会风气的变化，原本多发于50岁左右女性身上的宫颈癌如今也盯上了年轻女性。所以，宫颈癌的预防、诊断和治疗对提高女性健康水平是非常必要的。所幸的是，宫颈癌是一种发病原因比较清楚的恶性肿瘤，约99. 7%的宫颈癌是由高危型人乳头瘤病毒的持续或反复感染所致(Walboomers JM, Jacobs MV. Manos MM, et al.J Pathol, 1999 ；189(1) :50_53)。目前已确定的HPV型别已超过150个，常见的高危型有 15 种(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73 和 82 型)(Munoz N, Bosch FX, de SanjoseS, Herrero R, CastellsagueX, Shah KV, Snijders PJ, Meijer CJ (2003). N. Engl. J. Med. 348 (6) :518_27.)。其中，70% 的宫颈癌是由 HPV16、18 引起的；另夕卜，HPV31、 33、35 也是宫颈癌的主要致病因素(Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA,Shah KV,Snijders PJ,Peto J,Meijer CJ, Munoz N(1999). J. Pathol. 189(1) 12-9)。HPV型别分布有地域差别，在中国人群中，HPV16、52、58相对多见，而HPV73、82几乎没有。过去，宫颈癌筛查的主要方法有巴氏涂片法、阴道镜检查法及组织活检等，这些方法缺点明显，灵敏度不高特异性不强。而近年来出现的HPV DNA或RNA的检测对诊断高度病变的宫颈癌的灵敏度可达80% -100%，阴性预测值几乎是100%，所以，这种方法目前被认为是诊断宫颈癌的金标准。有研究者提出，对宫颈癌的准确诊断需要HPV DNA或RNA检测结果和细胞学检测结果的综合分析(Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, Bosch FX, Kummer JA,Shah KV,Snijders PJ,Peto J,Meijer CJ,Munoz N(1999).J.Pathol. 189(1) 12-9)。检测HPV DNA或RNA的常见方法包括测序法、杂交捕获法、原位杂交法及PCR法。 测序法的结果相对准确，但操作繁琐，且对操作者的要求较高，不适于临床应用；杂交捕获法如Digene公司的Hybrid CaptureII已被美国FDA批准并已在临床上应用，该法假阳性的问题仍然十分严重，且成本高，不宜在经济较不发达的发展中国家推广；原位杂交法灵敏度过低，这也就限制了其在临床上的大规模应用；传统的PCR法(电泳鉴定结果)虽然灵敏度尚可，但扩增后的产物暴露容易造成交叉污染，且步骤繁琐，临床应用的局限性过大。而上世纪90年代中期在传统的PCR基础上发展起来的实时荧光PCR技术不但灵敏度高特异性强，自动化程度高，成本适中，几乎不会造成污染，这些优点无疑给人乳头瘤病毒的早期诊断带来了福音。目前已上市的检测高危型HPV DNA的实时荧光PCR试剂有达安的8种型检测试剂 (国食药监械(准)字2007第3401103号)，上海复星的10种型检测试剂(国食药监械 (准)字2008第3400985号，分两管检测)以及潮州凯普的13种型检测试剂(国食药监械 (准)字2008第3401104号)等。达安和复星的HPV试剂所检测的型别过少，而凯普公司的HPV荧光PCR试剂虽然能检测常见的13种高危型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、 56、58、59、68)，但由于采用的是Taqman探针，特异性较差，只有85%左右。所以，为了满足临床的更高需求，本专利旨在利用分子信标技术开发特异性更强(大于95%)的13种常见高危型人乳头瘤病毒DNA的荧光PCR检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种检测临床宫颈样本中常见高危型人乳头瘤病毒DNA 的方法，特别是提供了一种使用分子信标荧光探针技术的实时PCR检测方法。该方法包括以下步骤(1)从待检的宫颈样本中提取病毒DNA; (2)使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信标探针对提取的病毒DNA进行实时PCR监测；(3)根据实时PCR的扩增曲线，分析并判断待检样本中是否有常见的高危型人乳头瘤病毒DNA。该方法的特征在于聚合酶链反应体系中使用的正向和方向引物共有9条，它们序列如下(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTAT TTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且实时PCR反应中所用的分子信标探针有(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的待检宫颈样本是指用无菌棉拭子或宫颈刷取疑似人乳头瘤病毒感染患者的宫颈脱落细胞，以及用于活检的组织标本或疣组织，这些样本需在低于4°C的环境下运送到检测实验室，并置于-70°C或-20°C冷冻保存根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的分子信标探针是用来检测宫颈样本中常见的高危型人乳头瘤病毒DNA，并且其中探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有DABCYL淬灭基团。序列表中，分别用FAM和DABCYL代表荧光基团和淬灭基团。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的实时PCR扩增所用的程序是 50 "C 120秒(1个循环)一95 °C 180秒(1个循环)一95 °C 5秒，45。C 45秒(5个循环)—950C 5秒，55°C 45秒(35个循环)。其中55°C是检测荧光的温度。本发明的另一个目的是提供用于检测临床宫颈样本中常见高危型人乳头瘤病毒 DNA的的试剂盒，该试剂盒包括(1)宫颈样本中人乳头瘤病毒DNA提取试剂；(2)聚合酶链反应混合液；(3)酶混合液；⑷阳性对照；(5)阴性对照。其特征在于聚合酶链反应体系中使用的正向和反向引物有(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且实时PCR反应中所用的分子信标探针有(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的DNA提取试剂由提取液A、提取液B 和提取液C组成。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应混合液由10XPCR缓冲液、dUTPs、正反向引物、分子信标探针等组成。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的酶混合液由普通Taq酶(Tag DNA聚合酶)和UNG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶)组成。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的阳性对照是经过测序确认过的含试剂盒检测范围内的一种高危型人乳头瘤病毒DNA片段的质粒；阴性对照是高压灭菌水。根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于聚合酶链反应的正向和反向引物有 (1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且实时PCR反应中所用的分子信标探针有(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。本发明提供一种检测临床样本中宫颈癌、尖锐湿疣的病原体——高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的方法，特别是一种实时PCR检测方法。该方法使用分子信标荧光探针技术， 能特异且灵敏地检测出13种常见的高危型人乳头瘤病毒，这13种HR-HPV是指HPV-16、18、 31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。本发明还进一步提供用于该临床检测的试剂盒。为了弥补市场上现有产品的缺陷和不足，本发明提供了一种适于检测常见高危型人乳头瘤病毒DNA的方法，该方法包括⑴从待检的宫颈样本中提取病毒DNA ；⑵使用合成的特定寡核苷酸引物和分子信标探针对提取的病毒DNA进行实时PCR ； (3)根据实时PCR 的扩增曲线，分析并判断待检样本中是否存在常见的高危型人乳头瘤病毒DNA。该方法的特征在于聚合酶链反应体系中使用的正向和方向引物共有9条，分别是(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且实时PCR反应中所用的分子信标探针有
( 10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO : 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO : 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO : 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的待检宫颈样本是指用无菌棉拭子或宫颈刷取疑似人乳头瘤病毒感染患者的宫颈脱落细胞，以及用于活检的组织标本或疣组织，这些样本需在低于4°C的环境下运送到检测实验室，并置于-70°C或-20°C冷冻保存。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的分子信标探针是用来检测宫颈样本中常见的高危型人乳头瘤病毒DNA，其中探针的5’端标记有FAM荧光基团，3’端标记有 DABCYL淬灭基团。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的实时PCR扩增所用的程序是 50 "C 120秒(1个循环)一95 °C 180秒(1个循环)一95 °C 5秒，45。C 45秒(5个循环)—950C 5秒，55°C 45秒(35个循环)。其中55°C是检测荧光的温度。简单地说，为了完成本发明的方法，首先提取待检临床宫颈样本中人乳头瘤病毒 DNA，然后以提取的DNA为模板，使用合成的正向和反向寡核苷酸引物进行PCR扩增；扩增时以FAM和DABCYL修饰的分子信标荧光探针检测常见的高危型人乳头瘤病毒DNA ；最后再根据PCR的扩增曲线判断标本中是否含有常见的高危型人乳头瘤病毒DNA。现针对本发明的几个主要步骤，分别详述如下1.人乳头瘤病毒DNA的提取本发明采用的是常见的人乳头瘤病毒DNA的提取方法。首先是在约50 μ 1的临床宫颈样本中加入蛋白酶k、Triton-100和PBS，混勻后于37°C温育1个小时，然后在96°C温育10分钟使得蛋白酶K失活，最后离心后取5μ 1上清用于PCR扩增。2.引物的设计和合成为了特异、高效地扩增待检临床宫颈样本中常见的高危型人乳头瘤病毒的靶DNA 片段，我们从GeneBank中调出各亚型(包括低危亚型)人乳头瘤病毒的Ll区DNA序列，然后通过DNAStar软件进行各亚型Ll区序列比较，在高危型序列相对保守的区域设计引物序列并进行合成。本发明中设计的正向和反向引物序列有(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)
(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)其中 Y = C/T = A/T ;R = A/G。3.探针的合成和标记我们从GeneBank中查询各亚型(包括低危亚型)人乳头瘤病毒的Ll区DNA序列， 然后通过DNAStar软件进行各亚型Ll区序列比较。为了使得试剂盒的特异性满足市场需求，我们在各高危型序列特异的区域设计分子信标探针并进行合成。我们共设计了 8条探针，序列如下(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中W = A/T ;K = T/G。4.核酸扩增体系的优化为了提高试剂盒检测的灵敏度和特异性我们首先对PCR扩增程序的各个参数(主要是退火温度和时间以及检测温度和时间)进行优化，最终选择的PCR运行程序是50°C 120秒(1个循环)—95°C 180秒(1个循环)—95°C 5秒，45°C 45秒(5个循环)一95°C 5秒，550C 45秒(35个循环)。其中55°C是检测荧光的温度。然后在这个PCR 扩增程序的基础上再对MgCl2浓度、酶、dUTPs、Tris-HCl、KCl、引物和探针的用量进行优化。5.扩增结果的分析和判断荧光明显比荧光域值(在荧光扩增曲线上根据基线设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段的任意位置上，但一般我们将荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍)高，扩增曲线光滑且明显呈S型趋势的才能判断为阳性； 否则为阴性。每个实验的阳性对照的扩增结果都应确定为阳性，而阴性对照的扩增结果都应是确定的阴性才可以。如前所述，由于本发明在各高危亚型人乳头瘤病毒DNA的Ll区相对保守的区域设计引物，在正反向引物间各高危亚型序列特异区域设计探针，使得常见高危亚型的人乳头瘤病毒DNA检测的灵敏度和特异性都完全可以符合临床需求。另外，本发明对MgCl2浓度、 酶、dUTPs、Tris-HCl, KC1、引物和探针的用量进行优化，使得实时PCR的扩增曲线更加美观和稳定，从而使得检测结果更加可靠。此外，本发明检测只用到最通用的荧光——FAM荧光，适用于市场上所有的荧光PCR仪检测，而且标记这种荧光的探针成本最低，从而使得试剂盒的成本也大大降低，利于大规模推广应用。本发明的另一个目的是提供用于检测常见高危型人乳头瘤病毒DNA的试剂盒，该试剂盒包括(1)宫颈样本中人乳头瘤病毒DNA提取试剂；(2)聚合酶链反应混合液；(3)酶混合液；(4)阳性对照；(5)阴性对照。
其特征在于聚合酶链反应体系中使用的正向和反向引物有(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4) (5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且实时PCR反应中所用的分子信标探针有(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的DNA提取试剂由提取液A(20mg/ml 蛋白酶k)、提取液B(Triton-IOO)和提取液C(10mM PBS, pH7. 0)组成。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的聚合酶链反应混合液(每人份)由 5μ 1 10XPCR buffer (500mM KCl,700mM Tris-Cl, pH8. 9,35mM MgCl2, 50 % v/v 甘油)、 0. 4μ 1 dUTPs(dATP、dUTP、dGTP、dCTP 各 25mM)、正反向引物(都是 100 μ Μ)各 0. 1 μ 1、分子信标探针(100 μ Μ)各0. 05 μ 1等组成。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的酶混合液由普通Taq酶(5υ/μ 1)和 UNG 酶(1U/ μ 1)按 ν/ν = 4 1 组成。根据本发明的一个优选实施方案，其中所说的阳性对照是经过测序确认过的含试剂盒检测范围内的一种高危型HPV DNA片段的质粒；阴性对照是高压灭菌水。根据本发明的再一个优选实施方案，其中用于聚合酶链反应的正向和反向引物有(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQ ID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQ ID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQ ID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQ ID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQ ID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3，(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQ ID NO 7)
(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQ ID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQ ID NO 9)并且实时PCR反应中所用的分子信标探针有 (10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQ IDNO 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQ ID NO 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQ ID NO 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQ IDNO 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO 17)其中Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G ；K = T/G。本发明的试剂盒不但对低危型人乳头瘤病毒DNA以及HPV DNA呈阴性的临床宫颈标本的特异性强，而且对常见高危型人乳头瘤病毒DNA的检测灵敏度高，能检测到浓度约为1. OX IO2-L OX 103COpieS/ml的各高危型人乳头瘤病毒DNA片段的质粒；引物序列非常保守，探针序列非常特异，所以试剂盒检测的准确性极高，漏检率极低，假阳率几乎没有。所以本发明的方法和试剂盒完全适用于临床宫颈样本中常见高危型人乳头瘤病毒DNA的确认。
图1显示各高危亚型的灵敏度检测结果。所用的模板是经过测序确认过的13种含高危型人乳头瘤病毒DNA片段的质粒，浓度约为1. OX IO2-L OX 103COpieS/ml。图2显示各低危亚型的特异性检测结果。所用的模板是经过测序确认过的5种含低危型人乳头瘤病毒DNA片段的质粒，浓度约为1. OX 107COpieS/ml。图3显示35例高危型人乳头瘤病毒DNA呈阳性的标本的检测结果。图4显示12例低危人乳头瘤病毒DNA呈阳性的标本以及12例不含人乳头瘤病毒 DNA的标本的检测结果。发明的
具体实施例方式实施例1 临床宫颈样本中人乳头瘤病毒DNA的提取从临床宫颈脱落细胞标本中取出50 μ 1到一高压过的1.5ml的离心管中，加入 10 μ 1提取液A(20mg/ml蛋白酶k)，8. 1μ 1提取液B (Triton-100)以及210μ 1提取液 CdOmM PBS，pH7. 0)，振荡混勻后于37°C温育60min ；接着96°C放置IOmin以失活蛋白酶k ； 最后12，500g离心lOmin，取5 μ 1上清进行PCR扩增。实施例2 靶核酸的PCR扩增在一 PCR反应管中加入单人份的PCR反应混合液，再加入0. 5 μ 1的酶混合液，最后再加入5μ1模板(待检模板或阴阳性对照品)，充分混勻后稍稍离心(约5秒)。然后将反应管放入荧光PCR仪(能检测到FAM的PCR仪)，按下列条件扩增50°C 120秒(1 个循环)—95°C 180秒(1个循环)—95°C 5秒，45°C 45秒(5个循环)—95 °C 5秒， 550C 45秒(35个循环)其中55°C是检测荧光的温度。所使用的PCR扩增体系中包括5μ 1IOXPCR buffer (500mM KCl, 700mMTris-Cl, pH8. 9,35mM MgCl2, 50 % v/v 甘油)、0. 4 μ 1 dUTPs(dATP、dUTP、dGTP、dCTP 各 25mM)、正反向引物(SEQ ID NO 1 到 SEQ ID NO :9，都是 ΙΟΟμΜ)各 0. 1μ 1、分子信标探针(SEQ ID NO 10 到 SEQ ID NO 17，都是 100 μ Μ)各 0· 05 μ 1、0· 5 μ 1酶混合液等组成，最后补水到50 μ 1实施例3 高危型人乳头瘤病毒DNA的灵敏度检测以经过测序确认过的13种含高危型人乳头瘤病毒DNA片段的质粒(浓度约为1.0X 102-1.0X 103COpieS/ml)为模板，使用本发明的试剂进行检测，检测结果参见附图1。从图1的结果可以看出，本发明的方法和试剂盒可以检测到浓度约为 1.0X IO2-L OX 103copies/ml的各高危型人乳头瘤病毒DNA模板，可以满足临床的需求。实施例4 低危型人乳头瘤病毒DNA的特异性检测以经过测序确认过的5种含低危型人乳头瘤病毒DNA片段的质粒(浓度约为 1.0X107copies/ml)为模板，使用本发明的试剂进行检测，检测结果参见附图2。从图2的结果可以看出，本发明的方法和试剂盒对浓度约为1.0X107COpieS/ml的各低危型人乳头瘤病毒DNA模板的检测结果呈阴性，说明试剂盒的特异性良好。实施例5 临床宫颈标本的检测使用本发明的方法和试剂盒，对59份已经凯普芯片试剂确认的的临床宫颈标本进行检测，其中35例含高危型人乳头瘤病毒DNA，12例含低危型人乳头瘤病毒DNA，另12例不含人乳头瘤病毒DNA。结果显示，35例高危型人乳头瘤病毒DNA阳性的标本用本发明的试剂盒检测，有两例呈阴性，33例为阳性，阳性检出率94. 29% (结果如图3)；而12例低危型人乳头瘤病毒DNA阳性的标本以及12例不含人乳头瘤病毒DNA的标本用本发明的试剂盒检测，结果均为阴性，特异性100% (结果如图4)。可见本发明的方法和试剂盒完全可以满足临床检测的需要。本发明的试剂与凯普芯片试剂的比较结果如下列表1所示。表1 分别使用本发明的试剂盒与凯普芯片试剂盒检测59例临床标本的结果比较
权利要求
1.一种用于检测常见高危型人乳头瘤病毒DNA的试剂盒，该试剂盒由(1)宫颈样本中人乳头瘤病毒DNA提取试剂；(2)聚合酶链反应混合液；(3)酶混合液；(4)阳性对照和(5) 阴性对照样品组成，特征在于其中所使用的正和反向引物是(1)5，-CTGAYCCCAATAAATTTGGTTTTCCWGA-3，(SEQID NO 1)(2)5，-CTGATCCAAATAAATTTGGGTTACCTGA-3，(SEQID NO 2)(3)5，-CAGATCCTAATAAGTTTGGRCTTCCRGA-3，(SEQID NO 3)(4)5，-AGGGTATTTCGCGTGACATTGCCC-3，(SEQID NO 4)(5)5，-AGAGTGTTTAGGGTTACCTTACCTG-3，(SEQID NO 5)(6)5，-CTAAGGCCAACACCYAAWGGCT-3‘(SEQ ID NO 6)(7)5，-TGACCACTTATGCCAACGC-3，(SEQID NO 7)(8)5，-CTAAGGCCAACACCAAGGGGCT-3，(SEQID NO 8)(9)5，-AYAATGGATGGCCACTGAGYC-3，(SEQID NO 9) 其中 Y = C/T ；W = A/T ；R = A/G。所使用的分子信标探针序列为(10)5，-FAM-CCCGGGGCCTGTGTWGGTGTTGACCGGG-DABCYL-3，(SEQID NO: 10)(11)5，-FAM-CGCGTGTGGGCCTGTGCTGACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO: 11)(12)5，-FAM-TGGGCCTGTGTTGGTTTAGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQID NO: 12)(13)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGCCTTGCCCA-DABCYL-3，(SEQID NO: 13)(14)5，-FAM-GGCTGGTKTGGGCCTGTACAGCC-DABCYL-3，(SEQID NO: 14)(15)5，-FAM-TGGGCTTGTGTAGGGGTGCCCA-DABCYL-3，(SEQID NO: 15)(16)5，-FAM-TGGGCATGTGTAGGTWTGGAGCCCA-DABCYL-3，(SEQID NO: 16)(17)5，-FAM-CGCGTTGGTGTGGGGTTGTGTGGAACGCG-DABCYL-3，(SEQID NO: 17) 其中 W = A/T ；K = T/G,
2.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的常见高危型人乳头瘤病毒是指中国人群中常见的宫颈癌相关人乳头瘤病毒，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68共13种型。
3.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的宫颈样本是指用无菌棉拭子或宫颈刷取的疑似人乳头瘤病毒感染患者的宫颈脱落细胞，以及用于活检的组织标本或疣组织，这些样本需在低于4°C的环境下运送到检测实验室，并置于-70°C或-20°C冷冻保存。
4.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的人乳头瘤病毒DNA提取试剂由提取液A、提取液B和提取液C组成。
5.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的聚合酶链反应混合液由10XPCR缓冲液、 dUTPs、正和反向引物、分子信标探针组成。
6.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的酶混合液由普通Taq酶(TagDNA聚合酶)和 UNG酶(尿嘧啶DNA糖基化酶)组成。
7.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的阳性对照是指经过测序确认过的含试剂盒检测范围内的高危型HPV DNA片段的质粒。
8.根据权利要求1的试剂盒，其中所说的阴性对照是高压灭菌水。
全文摘要
本发明涉及一种检测临床样本中宫颈癌、尖锐湿疣的病原体——高危型人乳头瘤病毒(HR-HPV)的方法，特别是涉及一种实时PCR检测方法，该实时PCR检测方法使用分子信标荧光探针技术，能特异且灵敏地检测出13种常见的高危型人乳头瘤病毒，这13种HR-HPV是指HPV-16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68。本发明还进一步涉及用于该临床检测的试剂盒。
文档编号C12Q1/68GK102199671SQ201010147430
公开日2011年9月28日 申请日期2010年3月24日 优先权日2010年3月24日
发明者宋庆涛, 蔡剑英 申请人:英科新创(厦门)科技有限公司