0R&F26W&Q122R)；
[0035] (25)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第 90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸（S90R&I83R&Q122R);
[0036] (26)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90 位的丝氨酸替换为精氨酸（D8K&S90R&F26V&I83R/D8K&S90R&F26W&I83R);
[0037] (27)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨 酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122 位的谷氨酰胺替换为精氨酸（Q122R&S90R&F26V&I83R/Q122R&S90R&F26W&I83R);
[0038] (28)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨 酰胺替换为精氨酸（D8K&S90R&I83R&Q122R);
[0039] (29)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122 位的谷氨酰胺替换为精氨酸（D8K&S90R&F26V&Q122R/D8K&S90R&F26W&Q122R);
[0040] (30)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第 122 位的谷氨酰胺替换为精氨酸（D8K&I83R&F26V&Q122R/D8K&I83R&F26W&Q122R);
[0041] (31)如SEQ ID NO. 1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸，同时第 26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精氨酸，同时第90 位的丝氨酸替换为精氨酸（D8K&I83R&F26V&S90R/D8K&I83R&F26W&S90R);
[0042] (32)如SEQ ID N0.1所示氨基酸序列的第8位的天冬氨酸替换为赖氨酸， 同时第26位的苯丙氨酸替换为缬氨酸或色氨酸，同时第83位的异亮氨酸替换为精 氨酸，同时第90位的丝氨酸替换为精氨酸，同时第122位的谷氨酰胺替换为精氨酸 (D8K&I83R&F26V&Q122R&S90R/D8K&I83R&F26W&Q122R&S90R)。
[0043] 本发明还提供一种编码所述环氧化物水解酶突变体的基因，其中一种突变体的基 因的碱基序列如SEQ ID NO. 16。
[0044] 本发明还提供一种携带所述基因的重组载体或重组细胞。
[0045] 本发明还提供一种获得所述环氧化物水解酶突变体的方法，包括如下步骤：（1) 将编码环氧化物水解酶的基因克隆到质粒pET28a (+)中，构建重组质粒pET28a (+) -EH ; (2)设计含有代表突变氨基酸的密码子碱基的互补引物，采用滚环PCR扩增质粒 pET28a(+)-EH，得到含有编码环氧化物水解酶突变体的基因序列的开环重组载体；（3)将 步骤（2)所得含有编码正确突变体的基因的PCR反应液经过DpnI内切酶消化，除去未突变 的原质粒，反应液直接转化感受态大肠杆菌DH5 α，挑取正确复制子，并提取正确突变质粒； (4)将正确的突变质粒转化大肠杆菌BL21 (DE3)，诱导表达。
[0046] 步骤（1)中编码环氧化物水解酶的基因从红球菌Rhodococcus opacus ML-0004 中获得。还进一步包括使用HisTrap FF crude Iml的"镍柱"对环氧化物水解酶进行纯化。
[0047] 所述诱导表达过程为：将步骤（4)获得的重组菌在含有50 μ g/L的卡那霉素的LB 培养基中37°C液体培养过夜，后接入含有50 μ g/L的卡那霉素的LB发酵液体培养基37°C 培养至0D600 = 0. 6,降温至28°C培养，加入最终浓度0.1 mM的诱导剂IPTG诱导8-12h，收 获内表达环氧化物水解酶的菌体。
[0048] 有关于本发明所涉及的环氧化物水解酶的研究还处于初阶阶段，目前只有编码 此蛋白质的蛋白质序列（GenBank登录号ABF01020)，其相应的核酸序列（GenBank登录 号DQ471957)和此蛋白的催化原理预测得到了报道。因此本发明利用主要利用"半理性 设计"的研究思路对此环氧化物水解酶进行改造。由于此环氧化物水解酶催化生成的 L(+)_酒石酸及其盐可以用"偏钒酸铵显色法"进行检测，因此本发明设计了针对此环氧化 物水解酶的"高通量筛选法"，引入"定向进化"的手段对此环氧化物水解酶进行了一轮筛 选。此环氧化物水解酶与属于卤代酸类脱齒水解酶超家族（haloacid dehalogenase-like hydrolases (HAD) superfamily)的四个具有高热稳定性的酶具有保守序列相似性，因此利 用MSAs对本发明所涉及的野生型环氧化物水解酶的蛋白质序列和这四个蛋白序列进行对 比，预测并得到对热稳定性有利的突变。利用"同源建模"建立本发明所涉及的野生型环氧 化物水解酶的蛋白质模型，之后使用"虚拟突变"预测核酸替代方式，得到对热稳定性有利 的突变。利用本发明中建立的"高通量筛选法"对已经得到的对蛋白质热稳定性有利的突 变点进行饱和突变，进一步提高了该环氧化物水解酶的热稳定性。
[0049] 通过对对选定位点的定点突变以及组合突变，本发明所得环氧化物水解酶突 变体的热稳定性性明显增强，单点突变体D8K、F26V/F26W、I83R、S90R、Q122R，双点组 合突变 D8K&F26V、D8K&F26W、D8K&I83R、D8K&S90R、F26V&I83R、F26W&I83R、F26V&S90R、 F26W&S90R、F26V&Q122R、F26W&Q122R、I83R&S90R、I83R&Q122R、S90R&Q122R，三点组合突 变 D8K&F26V&I83R、D8K&F26W&I83R、D8K&F26V&S90R、D8K&F26W&S90R、D8K&F26V&Q122R、 D8K&F26W&Q122R、D8K&I83R&S90R、D8K&I83R&Q122R、D8K&S90R&Q122R、S90R&F26V&I83R、 S90R&F26W&I83R、 Q122R&F26V&I83R、 Q122R&F26W&I83R、 S90R&F26V&Q122R、 S90R&F26W&Q122R、S90R&I83R&Q122R、D8K&S90R&F26V&I83RD8K&S90R&F26W&I83R，四 点组合突变 Q122R&S90R&F26V&I83R、Q122R&S90R&F26W&I83R、D8K&S90R&I83R&Q122R、 D8K&S90R&F26V&Q122R、 D8K&S90R&F26W&Q122R、 D8K&I83R&F26V&Q122R、 D8K&I83R&F26W&Q122R、D8K&I83R&F26V&S90R、D8K&I83R&F26W&S90R，和五点组合突变 D8K&I83R&F26V&Q122R&S90、D8K&I83R&F26W&Q122R&S90R 的热稳定性均有显著提高，并且突 变组合D8K&I83R&F26W&Q122R&S90R对pH值的适应性也有显著增强。对比原始环氧化物水 解酶，突变体D8K&I83R&F26W&Q122R&S90R经Ni柱纯化后在37°C下的比活力（U/mg)由76. 5 降为 75. LKni(IiimoVL)由 25. 3 升高到 29. l，KcatX103 (min 3 从 5. 82 变为 6. 20。最适反应 温度由35-40 °C提高到了为55-60 °C，在50 °C下的半衰期有8. 5min提高到了 293. 2. Imin。 可见，将在突变型环氧化物水解酶D8K&I83R&F26W&Q122R&S90R在大大提高热稳定性的基 础上并没有显著影响到野生型环氧化物水解酶的催化效能。
【附图说明】
[0050] 图1是环氧化物水解酶Ε?与四个来自卤代酸类脱卤水解酶超家族（haloacid dehalogenase-like hydrolases (HAD) superfamily)的酶的多重序列对比结果。
[0051 ] 图2是环氧化物水解酶同源性模拟结构示意图。
[0052] 图3是环氧化物水解酶及5种突变体的SDS-PAGE电泳图。W :野生型环氧化 物水解酶，1:突变型Q122R。2:突变型F26W。3:突变型I83R。4:突变型D8K。5:突变型 S90R〇
[0053] 图4是野生型环氧化物水解酶和突变型Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R在不同温度 下的比酶活（U/mg)。
[0054] 图5是野生型氧化物水解酶和突变型Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R在不同温度下 处理后的残余酶活（％ )。
[0055] 图6是野生型环氧化物水解酶和突变型Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R在不同pH值 下反应的酶的相对活力（％ )。
[0056] 图7是野生型氧化物水解酶和突变型Q122R&F26W&I83R&D8K&S90R在不同pH值条 件下处理后的残余酶活（％ )。
【具体实施方式】
[0057] 以下实施例中对应