流感病毒rna聚合酶结晶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域，涉及流感病毒RNA聚合酶结晶的方法，尤其涉及一种 流感病毒RNA聚合酶复合体的表达、纯化及结晶方法。
【背景技术】
[0002] 流感病毒，尤其是甲型流感病毒一直是威胁人类社会的一个大问题，它具有广泛 的宿主范围包括人、猪、马和禽类等，可以造成人类及动物上呼吸道感染，即流行性感冒，由 于其可以借空气迅速的传播，在上个世纪造成数次世界性的大流行。流感病毒属于正黏病 毒科，为负链单链RNA分节段基因组病毒，其基因组分为8段，目前发现至少可编码16个蛋 白。虽然目前存在不少抗流感病毒药物和疫苗，但是这些药物和疫苗主要针对流感病毒表 面蛋白，如HA，NA和M2。由于流感病毒在药物压力下可以通过突变或者基因重组改变其表 面抗原，这些表面蛋白经过突变的毒株将具有抗药性，从而可能引起无法控制的流感流行。 为了解决药物和疫苗的抗药性问题，人们在考虑改变思路来研发广谱性抗流感药物。
[0003] 随着对流感病毒复制机制的研究，人们逐渐将眼光集中在病毒的核糖核蛋白RNP 上。流感病毒RNP是流感病毒复制的核心组分。与病毒表面蛋白不同，流感病毒的RNP更 为保守，它由病毒基因组、RNA聚合酶和缠绕在病毒基因组RNA上的多个核蛋白组成，负责 病毒的转录和复制。流感病毒聚合酶是流感病毒复制的核心机器，它是由PA、PB1和PB2三 个亚基组成的大小约为250千道尔顿（KDa)的三元复合物，可以产生三种类型的RNA，分别 是cRNA、vRNA和mRNA，该聚合酶在病毒的生命活动中既参与病毒基因组的转录复制过程， 同时有文章报道该复合物也参与病毒的组装。
[0004] 尽管人们通过生物化学，遗传学，生物信息学和结构生物学对流感病毒聚合酶进 行了各方面的深入研究，提出了越来越精细的模型，关于聚合酶的工作机制方面仍然有很 多关键问题尚无法解决，例如：聚合酶如何调控转录和复制过程；在复制过程中，两个聚合 酶分子如何协调以启动和终止复制等；此外，聚合酶还参与病毒的组装和抵御宿主免疫系 统。为了解决这些问题，十分需要一个原子分辨率的聚合酶整体结构，然而由于流感病毒聚 合酶是一个250KD的复合物，为了以行使其多种功能，可能具有多种构象，这给结构生物学 研究、尤其是晶体结构的获得造成了极大的障碍，因此即使经过了数十年的努力，仍没有流 感病毒聚合酶整体复合物的结构得到报道。
[0005] 目前，人们在重组蛋白表达纯化，晶体优化和结构解析方面积累了大量的经验，通 常情况下，纯化得到足够量的稳定均一的蛋白质、并由此获得结晶仍然是大分子晶体结构 分析的主要瓶颈。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种流感病毒RNA聚合酶结晶的方法。
[0007] 本发明提供的方法，包括如下步骤：为先将流感病毒RNA聚合酶的PBl亚基编码基 因、PA亚基编码基因和PB2亚基截短体的编码基因在昆虫细胞中共表达、纯化，得到RNA聚 合酶，再将所述RNA聚合酶与RNA结合形成复合体，再将所述复合体结晶，得到流感病毒RNA 聚合酶晶体；
[0008] 所述PB2亚基截短体由PB2亚基自N末端起第1至N位氨基酸残基组成；N = 37-280中的任一自然数。
[0009] 上述方法中，所述PB2亚基截短体由PB2亚基自N末端起第1至N位氨基酸残基 组成；N = 37-130中的任一自然数。
[0010] 上述方法中，所述PB2亚基截短体为如下1)或2)或3):
[0011] 1)为PB2亚基氨基酸序列自N末端起前37位的氨基酸残基形成的蛋白；
[0012] 2)为PB2亚基氨基酸序列自N末端起前130位的氨基酸残基形成的蛋白；
[0013] 3)为PB2亚基氨基酸序列自N末端起前103位的氨基酸残基形成的蛋白。
[0014] 上述方法中，所述昆虫细胞为High Five细胞；
[0015] 所述流感病毒为A型流感病毒，所述A型流感病毒的病毒株具体为H5N1、HlNl或 H3N2。
[0016] 上述方法中，所述将流感病毒RNA聚合酶的PBl亚基编码基因、PA亚基编码基因 和PB2亚基截短体的编码基因在昆虫细胞中共表达采用Bac-to-BacBac-to-Bac杆状病毒 表达系统，所述Bac-t〇-BacBac-t〇-Bac杆状病毒表达系统中的供体质粒为pFastBac，大肠 杆菌为DHlOBac，昆虫细胞为Sf9。
[0017] 上述方法中，所述PBl亚基的氨基酸序列为序列表中序列1所示；
[0018] 所述PA亚基的氨基酸序列为序列表中序列3所示；
[0019] 所述PB2亚基的氨基酸序列为序列表中序列2所示；
[0020] 1)所示的所述PB2亚基截短体的氨基酸序列为序列表中序列2自N末端第1-37 位；
[0021] 2)所示的所述PB2亚基截短体的氨基酸序列为序列表中序列2自N末端第1-130 位；
[0022] 3)所示的所述PB2亚基截短体的氨基酸序列为序列表中序列2自N末端第1-103 位。
[0023] 上述方法中，所述PBl亚基的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列4所示；
[0024] 所述PA亚基的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列6所示；
[0025] 1)所示的所述PB2亚基截短体的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5自5' 末端第1-111位；
[0026] 2)所示的所述PB2亚基截短体的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5自5' 末端第1-390位；
[0027] 3)所示的所述PA亚基截短体的编码基因的核苷酸序列为序列表中序列5自5'末 端第1 _309位。
[0028] 上述方法中，所述纯化为将共表达得到的所述RNA聚合酶依次经亲和层析、离子 交换层析和凝胶层析，得到纯化后的RNA聚合酶；
[0029] 所述结晶采用的缓冲液由终浓度为2 % -30 %的PEG 1000-20000、终浓度为 50mM-500mMNaCL和浓度为100mM、pH值为8. 5的TrisHCL缓冲液组成；
[0030] 所述结晶采用的温度为4°C -20°c。
[0031] 由上述的方法制备的RNA聚合酶晶体也是本发明保护的范围。
[0032] 上述的RNA聚合酶晶体在抗流感病毒药物筛选或疫苗设计和制备中的应用也是 本发明保护的范围。
[0033] 本发明的实验证明，本发明利用了不同长度保留氨基端的PB2蛋白截短体与流感 病毒RNA聚合酶复合体其它两个亚基PA和PBl全长蛋白进行共表达、纯化及复合体组装获 得的不同的小复合体，这些小复合体均可在加入vRNA后结晶形成流感病毒RNA聚合酶晶 体。因此推断，不论使用何种流感病毒毒株，PB2亚基氨基端的这一区间内任何截短体都可 能帮助获得流感病毒RNA聚合酶复合体结晶。
[0034] 本发明的方法解决了长久以来的一个重要问题，即如何有效表达纯化一个含有大 部分流感病毒RNA聚合酶复合体成分的复合体，特别是含有完整PBl结构的该蛋白复合 物，并使之结晶，这一方法不仅为流感病毒聚合酶的结构解析奠定基础，同时，对抗流感病 毒药物筛选、广谱性疫苗和药物的设计研发进程也将具有重要意义和应用价值。
【附图说明】
[0035] 图1为含有PB2-37截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体纯化过程中图谱
[0036] 图2为含有PB2-37截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体纯化SDS-PAGE电泳图谱
[0037] 图3为含有PB2-130截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体分子筛纯化图谱
[0038] 图4为含有PB2-130截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体的纯化结果
[0039] 其中，图4A为含有PB2-130截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体电泳图，1-2为镍 柱层析后电泳、3为离子交换后电泳、4-5为分子筛层析后电泳
[0040] 图4B为离子交换图谱，蓝色曲线（上面的曲线）为样品在UV280的吸收情况；红 色曲线（下面的曲线）代表UV260吸收；黑色曲线代表离子交换盐浓度的增加过程。
[0041] 图4C为分子筛纯化图谱，其中黑色曲线代表不加 RNA时UV280和UV260吸收情况， 蓝色曲线代表加入RNA后复合体洗脱UV280和UV260吸收情况。
[0042] 图5为含有不同PB2截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体纯化后的电泳图谱
[0043] 图6为含有PB2-130截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体电镜结果及结晶图片
[0044] 其中A和B为二体及四体的电镜结构观察结果、C为四体加入vRNA后的结晶照片、 D为结晶电泳检测图
[0045] 图7为含有不同PB2截短体的流感病毒RNA聚合酶复合体的结晶图片
【具体实施方式】
[0046] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0047] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0048] 实验所用昆虫表达载体pFASTBAC和pFastBac-Dual及细胞培养基SF900II SFM 均购自Invitrogen公司。所需RNA均由Takara公司合成，镍亲和柱购自Qiagen公司 (Ni-NTA Agarose，产品目录号：30230)，SP阳离子交换柱（HITRAP SP HP，产品目录号： 17-1152-01)和 Superdex20016/60 凝胶层析柱（HiLoadl6/600Superdex200pg，产品目录 号：28-9893-35)购自GE公司。检测PA、PB1和PB2所用抗体通过表达相应蛋白多肽，免疫 兔获得多克隆抗体，经过实验验证特异性良好。
[0049] 昆虫细胞表达体系采用的是Invitrogen公司的Bac-to-Bac杆状病毒表达系统 (Bac -to-BaclSlBaculovirus Expression System，目录号：10359-016)，其中供体质粒为 pFastBac，进行重组病毒构建的大肠杆菌为DHlOBac (该菌株含有可在细菌和昆虫之间转 移和扩增的穿梭质粒Bacmid和能表达转座酶的Helper质粒），昆虫细胞为Sf9。所用昆虫 细胞培养基为Invitrogen公司的SF900II SFM。
[0050] 本发明的实施例均以流感病毒毒株Influenza virus/A/Guangdong/ g〇〇Se/196(H5Nl)(以下简称：H5N1)为例，但其余的流感病毒尤其是A型流感病毒毒株中的 流感病毒RNA聚合酶的三个亚基也可以通过本发明的方法进行结晶。
[0051] H5N1的RNA聚合酶聚合体的三个亚基包括PBl蛋白、PA蛋白和PB2蛋白，且PBl 蛋白的氨基酸序列为序列1，其编码基因的核苷酸序列为序列4 ;PA蛋白的氨基酸序列为序 列3,其编码基因的核苷酸序列为序列6 ;PB2蛋白的氨基酸序列为序列2,其编码基因的核 苷酸序列为序列5。
[0052] 实施例1、含有PB2-37截短体的流感病