一种枸橼酸西地那非有关物质的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种化学药物枸橼酸西地那非及其制剂的有关物质检测方法，属于药 物分析领域。
【背景技术】
[0002] 枸橼酸西地那非是一种有效治疗主观和客观原因引起的阴茎勃起功能障碍病症 的药物，是选择性磷酸二酯酶5型（PDE-5)的抑制剂，1997年3月经FDA批准作为处方药在 美国上市。枸橼酸西地那非的化学结构式如下：
[0003]
[0004] 阴茎勃起功能障碍的主要原因是阴茎海绵体供血不足，可能与缺少一氧化氮有 关。N0可使鸟苷酸环化酶（GC)活化，在活化的GC作用下，鸟苷酸（GTP)转变成环鸟苷酸 (cGMP) ;cGMP可被磷酸二脂酶5型（PDE-5)降解为cGMP-5^，后者无生物学效应，而cGMP 则可引起阴茎海绵体平滑肌血管舒张，使阴茎迅速充血而勃起。研究表明，枸橼酸西地那非 可通过抑制海绵体内分解cGMP的TOE-5,来增强N0的作用，从而发挥其治疗作用。
[0005] 药品中的有关物质是指药品中除主要成分之外的其他物质，它既可能是按既定工 艺生产过程中带入的其他原料、试剂及生产过程中产生的中间体、副产物和立体异构体等， 也可能是在正常贮存和运输过程中，由于环境条件的影响而产生的降解产物、聚合物等。药 物中含有的有关物质不但会降低药物疗效，还与人们的健康和生命安危有极其密切的关 系。药物安全性评价的一个重要内容就是药物中有关物质的含量控制。
[0006] 为了严格控制枸橼酸西地那非原料药及其制剂的质量，保证临床用药的安全有 效，需要建立其有关物质的检测方法。然而，枸橼酸西地那非合成路线较多，不同生产路线 及制剂工艺所带来的有关物质也不完全相同。常见的有关物质有以下7种（有关物质A~ G)，具体名称和结构见下表。
[0007]
[0009] 如何在同一色谱条件下对上表中的7种有关物质进行同时检测与分析，是枸橼酸 西地那非原料药及其制剂产品质量控制中的一个重要问题。
[0010] 现有技术中，USP35及EP8. 0对上表中枸橼酸西地那非中的有关物质D、E、G，以及 1-咪唑和5- [2-羟基-5- [ (4-甲基哌嗪-1-基）磺酰基]-苯基]-1-甲基-3-丙基-1，6-二 氢-7H-吡唑并-[4, 3-d]嘧啶-7酮，共5个有关物质进行了质量控制。色谱条件为：采 用C18色谱柱；流动相为水相（0. 7%三乙胺的水溶液，用磷酸调pH至3. 0):甲醇：乙腈= 58:25:17 ;洗脱方式为等度洗脱。而采用该方法对上表中7个有关物质A~G进行分析检 测时，有关物质C与E重合，有关物质D与F重合，专属性差，有关物质A出峰时间太早，主 成分峰的理论塔板数低，仅为1441。
[0011] 文献（AnalyticalSciences, 2003, 19, 1007 ~1011.)报道了对上表中枸橼酸 西地那非的有关物质A，以及5-(5-氯-2-乙氧基）-1-甲基-3-丙基-6, 7-1H-吡唑并 [4, 3-d]嘧啶-7酮、1-甲基-4-硝基-3-丙基吡唑-5-羧酸、1-甲基-4-硝基-3-丙基 咪唑-5-甲酰胺和5-(2-乙氧基）-1-甲基-3-丙基-6, 7-二氢-1H-吡唑并-[4, 3-d]嘧 啶-7-酮，共5个有关物质进行质量分析的方法。色谱条件为：采用C18色谱柱；流动相为 含0. 05mol/ml磷酸二氢钾的水溶液：乙腈=30:70 ;洗脱方式为等度洗脱。而采用该方法 对上表中7个有关物质A~G进行检测时，有关物质A与E重合，有关物质B未检出，专属 性差，主成分峰理论塔板数低，仅为1477。
[0012] 文献（InternationalJournalofComprehensivePharmacy, 2011，7, 1 ~6.)报 道了一种枸橼酸西地那非有关物质的检测方法。该方法采用C18色谱柱；流动相为水相（含 0. 05mol/ml磷酸二氢钾的水溶液，用氢氧化钾溶液调pH至5. 8):乙腈：甲醇=30:50:20， 洗脱方式为等度洗脱。采用该方法对上表中7个有关物质A~G进行分析检测时，有关物 质A与有关物质D重合，专属性差。
[0013] 文献（中国药科大学学报，2001，32, 429~431.)对枸橼酸西地那非的4个中间 体的分离检测进行了研究。该方法采用C18色谱柱；流动相为水相（0. 015mol/ml三乙胺的 水溶液，用磷酸调pH至6.0):乙腈= 42:58,洗脱方式为等度洗脱。采用该方法对上表中7 个有关物质A~G进行分析检测时，有关物质D未检出，有关物质A、E分离度不好，理论塔 板数低。
[0014] 综上所述，现有方法均不能同时检测上表中枸橼酸西地那非的7个有关物质，且 色谱条件中的流动相含有不挥发性盐或三乙胺，不能用于液质联用分析，影响后续研究工 作的开展。
[0015] 针对现有技术和方法无法同时检测上表中枸橼酸西地那非的7种有关物质，给枸 橼酸西地那非原料药及其制剂产品的质量控制带来困难。本发明通过大量的实验研究，建 立了同时检测枸橼酸西地那非中7种有关物质的方法，可用于枸橼酸西地那非原料药及其 制剂产品的质量研究和质量控制。
【发明内容】
[0016] 本发明的目的在于提供一种同时检测枸橼酸西地那非中7种有关物质的高效液 相色谱方法。为实现上述目的，本发明提供如下技术方案，该方案包括以下步骤：
[0017] 步骤1:制备系统适用性溶液：
[0018] 取有关物质A、B、C、D、E、F、G和枸橼酸西地那非对照品，精密称定，加流动相配制 成混合对照溶液，其中有关物质A~G的浓度为1~10μg/ml，枸橼酸西地那非的浓度为 100 ~300μg/ml〇
[0019] 步骤2 :按以下高效液相色谱条件进行有关物质测定：
[0020] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含1~10mm〇l/ml醋酸铵的水溶液，用氨 水调pH至5. 0~8. 0为流动相A相，以乙腈：甲醇=1 :1~10为流动相B相，柱温25~ 35°C，流速为0. 5~2ml/min，检测波长为292nm，用HPLC进行梯度洗脱。
[0021] 优选的，步骤2中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含2~8mmol/ml醋酸铵 的水溶液，用氨水调pH至6. 5~7. 5为流动相A相，以乙腈：甲醇=1 :1~5为流动相B 相，柱温27~32°C，流速为0. 8~1. 2ml/min，检测波长为292nm，用HPLC进行梯度洗脱。
[0022] 更为优选的，步骤2中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含5~6mmol/ml醋 酸铵的水溶液，用氨水调pH至6. 8~7. 2为流动相A相，以乙腈：甲醇=1 :1~3为流动相 B相，柱温29~31°C，流速为0. 9~1.lml/min，检测波长为292nm，用HPLC进行梯度洗脱， 流动相梯度如下：
[0023]
[0024] 主成分的理论塔板数大于70000,所有峰之间的分离度大于3. 5。
[0025] 本发明提供的方法与现有已知方法的对比及实验结果如下：
[0026]
L0027」 本友明提供的万法简使、高效、分离度高，η」以问时分离检测枸櫞酸曲地那非中的 7种有关物质，且流动相可适用于质谱检测，方便通过质谱分析未知杂质的结构，可用于枸 橼酸西地那非原料药及其制剂产品的质量研究和质量控制。
[0028] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细说明。根据本领域普通技术 知识和常用手段做出各种替换和变更，均包括在本发明所保护的技术方案之内。
【附图说明】
[0029] 图1:USP35和EP8.0方法的系统适用性色谱图；
[0030] 图 2 :文献（AnalyticScience, 2003, 19, 1007 ~1011.)方法的系统适用性色谱 图；
[0031] 图 3:文献（InternationalJournalofComprehensivePharmacy, 2011，7, 1 ~ 6.)方法的系统适用性色谱图；
[0032] 图4:文献（中国药科大学学报，2001，32, 429~431.)的系统适用性色谱图；
[0033] 图5 :实施例1的系统适用性色谱图；
[0034] 图6 :实施例2的系统适用性色谱图。
【具体实施方式】 [0035]实施例1
[0036] 步骤1:制备系统适用性溶液：
[0037] 取有关物质A、B、C、D、E、F、G和枸橼酸西地那非对照品，精密称定，加流动相配制 成混合对照溶液，其中有关物质A~G的浓度为5μg/ml，枸橼酸西地那非浓度为200μg/ ml〇
[0038] 步骤2 :按以下高效液相色谱条件进行有关物质测定：
[0039] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含5mmol/ml的醋酸铵，用氨水调pH至7. 0 为流动相A相，以乙腈：甲醇=1 :1为流动相B相，柱温30°C，流速为lml/min，检测波长为 292nm，用HPLC进行梯度洗脱，流动相梯度如下：
[0040]
[0041] 主成分的理论塔板数为73453,所有峰之间的分离度达到3. 85以上。
[0042] 系统适用性色谱图见图5。
[0043] 实施例2
[0044] 步骤1:制备系统适用性溶液：
[0045] 取有关物质A、B、C、D、E、F、G和枸橼酸西地那非对照品，精密称定，加流动相配制 成混合对照溶液，其中有关物质A~G的浓度为5μg/ml，枸橼酸西地那非浓度为200μg/ ml〇
[0046] 步骤2 :按以下高效液相色谱条件进行有关物质测定：
[0047] 以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以含6mmol/ml的醋酸铵，用氨水调pH至7.0 为流动相A相，以乙腈：甲醇=1 :1为流动相B相，柱温30°C，流速为lml/min，检测波长为 292nm，用HPLC进行梯度洗脱，流动相梯度如下：
[0048]
[0049] 主成分的理论塔板数为89369,所有峰之间的分离度达到3. 59以上。
[0050] 系统适用性色谱图见图6。
【主权项】
1. 一种枸橼酸西地那非有关物质的检测方法，包括以下几个步骤： 步骤1 :制备系统适用性溶液：取有关物质A、B、C、D、E、F、G和枸橼酸西地那非对照品， 精密称定，加流动相配制成混合对照溶液，其中有关物质A~G的浓度为1~10 μ g/ml，枸 橡酸西地那非浓度的为100~300 μ g/ml ; 步骤2 :按以下高效液相色谱条件进行有关物质测定：以十八烷基硅烷键合硅胶为填 充剂，以含1~10mm〇l/ml醋酸铵的水溶液，用氨水调pH至5. 0~8. 0为流动相A相，以乙 腈：甲醇=1 :1~10为流动相B相，柱温25~35°C，流速为0. 5~2ml/min，检测波长为 292nm，用HPLC进行梯度洗脱。2. 根据权利要求1所述，其特征在于，步骤2中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以 含2~8mmol/ml醋酸铵的水溶液，用氨水调pH至6. 5~7. 5为流动相A相，以乙腈：甲醇 =1 :1~5为流动相B相，柱温27~32°C，流速为0· 8~1. 2ml/min，检测波长为292nm， 用HPLC进行梯度洗脱。3. 根据权利要求1所述，其特征在于，步骤2中以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以 含5~6mmol/ml醋酸铵的水溶液，用氨水调pH至6. 8~7. 2为流动相A相，以乙腈：甲醇 =1 :1~3为流动相B相，柱温29~31°C，流速为0. 9~1. lml/min，检测波长为292nm， 用HPLC进行梯度洗脱，流动相梯度如下：主成分的理论塔板数大于70000,所有峰之间的分离度大于3. 5。
【专利摘要】本发明公开了一种枸橼酸西地那非有关物质的检测方法。该方法采用高效液相色谱法，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，醋酸铵水溶液为流动相A，乙腈-甲醇为流动相B，检测波长为292nm，梯度洗脱。该方法简便、高效、分离度高，可以同时分离检测枸橼酸西地那非中的7种有关物质，且流动相可适用于质谱检测，可用于枸橼酸西地那非原料药及其制剂产品的质量研究和质量控制。
【IPC分类】G01N30/06, G01N30/02
【公开号】CN105334275
【申请号】CN201510888927
【发明人】陈再新, 王璠, 王勇军, 黄静, 周慧琴
【申请人】常州亚邦制药有限公司, 江苏亚邦爱普森药业有限公司
【公开日】2016年2月17日
【申请日】2015年12月5日