专利名称：一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术领域，尤其涉及一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统及其应用。
背景技术：
环二鸟苷酸(cyclicbis (3，_5’)diguanylic acid, c-d1-GMP)是细菌体内普遍存在的第二信使分子，参与调节细菌的多种生理功能，尤其在细菌生物膜形成和致病因子产生中起着至关重要的调节 作用。细菌生物膜是细菌为抵抗外界不良环境，通过自身产生的胞外多糖等多聚物相互粘连形成的附着在细菌群落表面的膜状物。细菌生物膜可以用于进行水质净化，在维持生态环境特别是水生环境平衡中也占据重要位置，并且能够促进有机物与无机物的相互转化。细菌生物膜对人们的生产生活也具有一定的危害，如细菌生物膜对抗生素和宿主免疫防御机制的抗性很强，从而导致严重的临床问题，尤其是慢性和难治的感染性疾病；细菌生物膜可污染与人类生活相关的设施，如空调系统、供水系统、食品加工设备，甚至医疗用具等，由此造成传染病的流行；除健康问题外，细菌生物膜还可在工业、运输、军事等诸多领域给人类社会带来严重危害，造成巨大经济损失，比如固着在船舶底部造成行进阻力增大、腐蚀金属，堵塞管道等。研究表明，细胞内c-d1-GMP作为一个重要信号分子，控制着大量分泌蛋白或细胞表面相关蛋白基因的表达，细胞内高水平的c-d1-GMP导致细胞从浮游的、运动的生活方式向固定的、生物被膜相关的生活方式转变，从而易于形成细菌生物膜。c-d1-GMP通过与核糖开关(riboswitch)结合,从而达到对基因表达的精细调节。核糖开关被定义为一类位于mRNA3’ -或5’ -非翻译区上，能够结合小分子代谢物以调控基因的转录和翻译的mRNA顺式作用元件，多数核糖开关都可以分成2个结构域:适体结构域(aptamer domain, AD)和表达结构域(expression domain, EPD) AD 是一个高度折叠的结构，能选择性地与特定的代谢产物结合。AD形成高度折叠的二级或者三级结构，选择性地与靶代谢物结合，自身的构象发生变化，导致下游EPD的RNA折叠变化，形成选择性的茎环结构，直接调节基因的表达。目前已证实多个与c-d1-GMP特异性结合的riboswitch,c-d1-GMP的两个碱基G与核糖开关的特异位点的碱基C形成Watson-Crick配对,从而实现对下游基因表达的调节。不同浓度的c-d1-GMP通过对核糖体开关的调节，使信号级联放大，对细胞的状态产生重大影响。如何检测出细胞内c-d1-GMP的含量显得很重要，现有技术中还没有一种方法能用于对活细胞中的c-d1-GMP进行检测。
发明内容
本发明提供了一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统，利用该报告系统能对活细胞中c-d1-GMP含量进行检测。一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统，该报告系统由依次连接的启动子、核糖开关、SD序列和报告基因组成。启动子-核糖开关-SD序列组成基因表达调控序列，核糖开关主要依据其表达结构域的构象变化，在转录和翻译两个水平上调节报告基因的表达。就转录水平调控而言，核糖开关的适体结构域特异结合细胞内的c-d1-GMP，促使表达结构域中形成转录终止子，导致RNA聚合酶从poly U末端脱落，转录终止；G+菌的核糖开关倾向于利用此机制。就翻译水平调控而言，核糖开关的适体结构域特异结合细胞内的c-d1-GMP，形成特定的二级结构妨碍核糖体识别SD序列，从而阻断翻译起始；G—菌的核糖开关倾向于利用此机制。最终，通过检测报告基因编码的蛋白的表达量，即可获得细胞内c-d1-GMP含量。组成基因表达调控序列的三个片段(启动子、核糖开关、SD序列)可分别经扩增得到再融合到同一序列上，也可从同时包含有这三个片段(即含有启动子-核糖开关-SD序列)的基因组中经一次扩增得到。在一个具体实施方式
中，所述的基因表达调控序列即是经一次扩增从shewanellaoneidensis的基因组得到的。所述的启动子为shewanella oneidensis中S0-1072基因(GenBank号为NP_716 699)的强启动子区域，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。核糖开关(在该基因组中的位置为1112520-1112568)的核苷酸序列如SEQ ID N0.2所示。SD序列的核苷酸序列如SEQ ID N0.3所示。所述的报告基因可选用Lac Z基因、荧光素酶基因或荧光蛋白基因；优选为Lac Z基因，核苷酸序列如SEQ ID N0.5所示。Lac Z基因编码P半乳糖苷酶，以邻硝基苯-3-D半乳吡喃糖苷(ONPG)为底物，利用比色法即可检测酶活性，操作简便，且检测动力学范围可达六个数量级。利用c-d1-GMP的结构类似物c-d1-AMP分析发现，本发明的报告系统对c-d1-GMP具有极高的特异性，c-d1-AMP的加入对检测结果无影响。本发明还提供了含有所述报告系统的重组载体或表达系统。所述重组载体的原始载体可选用pHGROl或pHGR03。本发明还提供了所述的报告系统在检测活细胞内环二鸟苷酸含量中的应用，包括:将所述的报告系统转入待测细胞，将重组细胞置于培养液中培养，至培养液0D_值为0.4-0.6，测定重组细胞中报告基因的表达量，根据以下公式计算待测细胞内环二鸟苷酸的含量:环二鸟苷酸含量=_10721n(miller unit-CK)+793.35 ;其中，miller unit为重组细胞中报告基因的表达量；CK为待测细胞中报告基因的本底水平表达量。报告基因(以Lac Z基因为例)的表达量的测定方法为:将V1体积的0D_值为0.4-0.6的重组细胞培养液离心，去上清；加入V2体积的裂解液，裂解完成后，对细胞裂解液离心、取V3体积的上清与V4体积的ONPG反应；反应完成后，测定反应液的OD42。值；即miller unit的计算公式为:miller unit= (1000XOD420) / (TXVXOD600)；其中
权利要求
1.一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统，其特征在于，该报告系统由依次连接的启动子、核糖开关、SD序列和报告基因组成。
2.如权利要求1所述的报告系统，其特征在于，所述的启动子为S0-1072基因的强启动子区域，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。
3.如权利要求1所述的报告系统，其特征在于，核糖开关的核苷酸序列如SEQID N0.2所示。
4.如权利要求1所述的报告系统，其特征在于，所述的报告基因为LacZ基因、荧光素酶基因或荧光蛋白基因。
5.如权利要求4所述的报告系统，其特征在于，所述的报告基因为LacZ基因。
6.含有如权利要求1 5任一所述的报告系统的重组载体。
7.含有如权利要求1 5任一所述的报告系统的表达系统。
8.如权利要求1 5任一所述的报告系统在检测活细胞内环二鸟苷酸含量中的应用，包括: 将所述的报告系统转入待测细胞，将重组细胞置于培养液中培养，至培养液OD6tltl值为·0.4-0.6，测定重组细胞中报告基因的表达量，根据以下公式计算待测细胞内环二鸟苷酸的含量: 环二鸟苷酸含量=_10721n (miller unit-CK) +793.35 ； 其中，miller unit为重组细胞中报告基因的表达量；CK为待测细胞中报告基因的本底水平表达量。
全文摘要
本发明公开了一种检测活细胞内环二鸟苷酸含量的报告系统及其应用。该报告系统由依次连接的启动子、核糖开关、SD序列和报告基因组成。所述的应用包括将所述的报告系统转入待测细胞，将重组细胞置于培养液中培养，至培养液OD600值为0.4-0.6，测定重组细胞中报告基因的表达量，根据以下公式计算待测细胞内环二鸟苷酸的含量环二鸟苷酸含量=-1072ln(miller unit-CK)+793.35；其中，miller unit为重组细胞中报告基因的表达量；CK为待测细胞中报告基因的本底水平表达量。利用本发明报告系统能方便地对活细胞内的c-di-GMP含量进行检测，操作方法简便易行，检测结果真实可信。
文档编号C12Q1/02GK103173547SQ201310078510
公开日2013年6月26日 申请日期2013年3月12日 优先权日2013年3月12日
发明者高海春, 张海燕 申请人:浙江大学