专利名称：特氏丙酸杆菌细菌素抗菌代谢物的制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及特氏丙酸杆菌菌株产生的含有细菌素的天然抗菌代谢物的 制备方法，以及上述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物在食品防腐保鲜， 消毒剂，抗感染药物，动植物病害防治和医药等方面的用途。
背景技术：
目前最常见的食品防腐剂是苯甲酸，苯甲酸钠，山梨酸，山梨酸钾等 化学防腐剂。但是化学防腐剂潜在的安全隐患愈来愈不容忽视，而生物防 腐剂具有抑菌物质多，来源广泛，安全无毒、性能稳定等优点，作为新型 的天然防腐剂在食品保存中具有巨大的应用潜力，已日益受到人们的关注。
细菌素是细菌通过核糖体合成机制生成的一大类蛋白或多肽类物质，
最初发现于细菌之间的拮抗作用中。随着乳链菌肽(Nisin)作为第一个应 用到食品的细菌素，人们对微生物代谢产生的细菌素的研究越来越深入， 而细菌素在食品保藏，食品发酵和医药卫生等方面已显示出了重要意义。 某些乳酸菌细菌素能抑制食品中常见的腐败菌和一些病原菌。乳酸菌细菌 素具有相对稳定的化学性质和强的抑菌活性，可广泛应用于食品天然防腐 剂的开发。细菌素作为一种蛋白、多肽类物质，抑菌活性强，对热、酸等 稳定性好，可被酶作用而降解，不会在人体内残留，具有较高的安全性， 在食品中的应用范围广。丙酸杆菌广泛存在于乳制品、土壤、青贮铜料中。 特氏丙酸杆菌是多形态、无芽孢形成、杆状的革兰氏阳性菌，它来自奶制 品、无致病性，已经应用在丙酸和乙酸的工业发酵中。目前巿场上存在的 细菌素作为食品防腐剂的产品主要有以下两种一、由乳酸菌产生的Nisin，
也是目前研究最清楚的细菌素。乳球菌素Nisin介导的细胞溶菌是通过改 变细胞表面自由能，进而使细胞通透性发生改变最终导致细胞裂解。Nisin 对革兰氏阳性菌有抑菌作用，包括病原菌如李斯特菌单核细胞，也可以抑制杆菌、梭菌的过量生长。Nisin与金属螯合剂EDTA、酒石酸、磷酸盐结 合可抑制更多的细菌如G-大肠杆菌0154. 117。做为商品Nisin已在欧洲上 巿几年，用于保存多种食品包括乳制品、奶酪、罐装蔬菜和儿童食品。1988 年被美国食品及药品管理局(FDA)批准可用于巴氏灭菌的奶酪和已加工的 奶酪，防止梭菌孢子的大量繁殖和梭菌毒素的过量产生。二、是由 Uctobaccilluus rhamnosus IX 705和P. freudenreichii JS发酵得至ij
的Bioprofit，据报道它可以抑制乳产品中的酵母菌和酸性面包中的芽孢 杆菌，这种抑制效果是由于这两种菌之间的协同作用。
目前，特氏丙酸杆菌(户r^/朋/^"eW鹏.Moe/72'/)保藏于美国模 式典型物收集中心(ATCC),保藏编号ATCC 4874。特氏丙酸杆菌细菌素的 抗菌代谢产物的制备方法及其应用尚未见诸报道。
本发明所要解决的技术问题是提供 一 种特氏丙酸杆菌 (/Yo/7/'朋/'&"er/鹏.Moe/ 27) ATCC 4874细菌素抗菌代谢物组合物的制
备方法，以及这种特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢产物在食品防腐保鲜， 消毒剂，抗感染药物，动植物病害防治和医药等方面的应用。
本发明技术方案， 一种特氏丙酸杆菌细菌素抗菌代谢物的制备方法， 包括下列步骤
a. 培养特征
特氏丙酸杆菌菌株(尸rop/o/7/6ac^er/咖.f力oe/n7)保藏于美国模式 典型物收集中心(ATCC)，保藏编号ATCC 4874,该菌培养于SLB固体培养基 中，形成小而突起菌落.呈奶油色、黄色、橙色或深红色，培养温度30 ~ 37 °C;
b. 特氏丙酸杆菌的活化
安瓿管开封后，用无菌吸管，吸取O. 3~0. 5ml适宜的液体培养基，滴
发明内容入安瓿管内，轻轻振荡，使特氏丙酸杆菌菌体溶解呈悬浮状，取O. 1~0. 2ml 菌体悬浮液，注入SLB液体培养基内，然后3(TC静止深层培养48h，培养 物即可用做发酵种子；
c.特氏丙酸杆菌的发酵
接种量2 ~ 8% (v/v),发酵温度29. 5°C ~ 30. 5°C，发酵的碳源由葡萄糖、 乳糖、蔗糖、果糖或麦芽糖中的任何一种或一种以上组成，碳源用量为培 养基的2~4%(w/v)，氣源由胰蛋白胨、酵母粉、玉米浆、酵母提取物、乳 酸钠中的任何一种或一种以上组成，氮源用量为培养基的2-3%(w/v),无 机盐由LHP04、 KH2P04、 MnS04中的任何一种或一种以上组成，无机盐用量为 培养基的0. 05~0. 30%(w/v)，琼脂用量为培养基的0. 5~3%(w/v)，其余为 水，密闭厌氧发酵4 6天，即可得到所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢 物。
所述特氏丙酸杆菌细菌素抗菌代谢物的制备方法，其步骤c得到的含 有所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物的发酵液进一步旋转蒸发或超 滤，使体积浓缩到原来的1/3 ~ 1/6，然后在冷冻干燥机上进行冷冻干燥， 预冻温度为-45。C，干燥温度设为-2(TC,干燥12-24h直到水分完全升华为 止，得到所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物的千粉，4'C密封保存。
所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物在食品防腐保鲜，消毒剂，抗 感染药物，动植物病害防治和医药领域中用于抑制革兰氏阴性菌，霉菌和 酵母菌的应用。
发明的有益效果，本发明通过微生物发酵技术，得到特氏丙酸杆菌细 菌素的抗菌代谢物，其中的细菌素与丙酸，乙酸，乳酸等其他成分相互协 同作用，该抗菌代谢物的抑菌谱不同于一般的细菌素仅仅抑制其近源的微 生物，抑菌谱广，可以用于食品防腐保鲜，消毒剂，抗感染药物，动植物 病害防治和医药等领域，抑制革兰氏阴性菌，霉菌和酵母菌的生长。本发明搡作方便，生产成本低，应用前景广阔。
具体实施例方式
下面通过实施例对本发明进一步详细描述， 一种特氏丙酸杆菌细菌素
抗菌代谢物的制备方法，包括下列步骤
a. 培养特征
特氏丙酸杆菌菌株(Propionibacterium . thoenii)保藏于美国模式 典型物收集中心(ATCC),保藏编号ATCC 4874，该菌培养于SLB固体培养基 中，形成小而突起菌落.呈奶油色、黄色、橙色或深红色，培养温度30~ 37°C;
b. 特氏丙酸杆菌的活化
安瓿管开封后，用无菌吸管，吸取O. 3 0.5ml适宜的液体培养基，滴 入安瓿管内，轻轻振荡，使特氏丙酸杆菌菌体溶解呈悬浮状，取0.1~0. 2ml 菌体悬浮液，注入SLB液体培养基内，然后30'C静止深层培养48h,培养 物即可用做发酵种子；
c. 特氏丙酸杆菌的发酵
接种量2 ~ 8%(v/v)，发酵温度29. 5°C ~ 30. 5°C,发酵的碳源由葡萄糖、 乳糖、蔗糖、果糖或麦芽糖中的任何一种或一种以上组成，碳源用量为培 养基的2~4%(w/v)，氮源由胰蛋白胨、酵母粉、玉米浆、酵母提取物、乳 酸钠中的任何一种或一种以上组成，氮源用量为培养基的2~3%(w/v),无 机盐由K2HP04、 KH2P04、 MnS04中的任何一种或一种以上组成,无机盐用量为 培养基的0. 05 ~ 0. 30%(w/v)，琼脂用量为培养基的0. 5 ~ 3%(w/v),其余为 水，密闭厌氧发酵4~6天，即可得到所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢 物。
如果用于IO升发酵罐的培养，同样按2~8% (w/v)接种量将活化的特氏丙酸杆菌接入发酵培养液中，发酵培养液的组成同上，设定发酵罐温度
为29. 5°C ~ 30. 5°C，调节通气量后密闭使罐压保持在0. 04 ~ 0. 05MPa之间， 培养4 ~ 6天后得到所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物。
所述特氏丙酸杆菌细菌素抗菌代谢物的制备方法步骤c得到的含有所 述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物的发酵液可以进一步旋转蒸发或超 滤，使体积浓縮到原来的1/3-1/6，然后在冷冻干燥机上进行冷冻干燥， 预冻温度为-45'C，干燥温度设为-2(TC，干燥12~24h直到水分完全升华 为止，得到所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物的干粉，4"C密封保存。
所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物在食品防腐保鲜，消毒剂，抗 感染药物，动植物病害防治和医药领域中用于抑制革兰氏阴性菌，霉菌和 酵母菌的应用。
实施例1
种子培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物10g， 60°/。乳酸钠16. 7ml， K2HP04 0. 25g， MnS040. 005g,加蒸馏水至1000ml， pH7. 0
发酵培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物10g，葡萄糖20g， K2HPO40. 25g， MnSO,O. 005g,琼脂20g，加蒸馏水至1000ml， pH7. 0
将保藏号为ATCC 4874的特氏丙酸杆菌接种于种子培养基中3(TC培养 48h得到种子液，将种子液按照发酵体积的4%接种量接入冷却后的发酵培 养基中，3(TC培养5d后得到含有细菌素的抗菌代谢产物发酵液。将得到的 发酵液，进行旋转蒸发，使体积缩小到原来的1/5,然后后冷冻干燥机上进 行冷冻干燥，到水分完全升华为止，得到发酵液的干粉后4 。C密封保存。 对实施例1得到特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物进行抗菌谱的测定。 采用琼脂扩散法分别以大肠杆菌，铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、枯草 杆菌、深红酵母、假丝酵母等做为指示菌，测定该丙酸杆菌代谢物的抗菌 谱，其结果如下表l特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物抑菌谱试验结果
试验菌株 抑菌性的有无
G+枯草芽胞杆菌-
巨大芽胞杆菌-
金黄色葡萄球菌—
G—大肠杆菌1 #+
大肠杆菌2 #+
鼠伤寒沙门氏菌+ +
铜绿假单胞菌+ +
深红酵母+
假丝酵母+
酿酒酵母+
"++"表示抑菌活性较强，"+ "表示有抑菌活性，"-"表示无
抑菌活性。
表2特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物对霉菌孢子的抑制试验结果
培养时间_孢子萌发率_
青霉 对照 黑曲霉 对照
4h 0.0% 611% ±0.7% 0.0%38. 6% ±1.1%
8h 0.0% 100.0% 0.0% 100.0%
12h 12. 1% ± 0. 9% 100. 0% 3. 4% ± 1. 2% 100. 0%
表2数据表明丙酸杆菌代谢物对青霉和黑曲霉表现出了非常强的抑制 作用。8h内空白对照的孢子完全萌发，而添加了丙酸杆菌代谢物的完全没 有萌发；12h后添加了丙酸杆菌代谢物的青霉和黑曲霉，其萌发率最高也分 别只有13. 0%和4. 6%,与空白对照有极其显著差异(P〈0. 01)。
本发明所述特氏丙酸杆菌代谢产物能抑制部分革兰氏阴性菌，部分酵母 菌和霉菌，不能抑制革兰氏阳性菌。实施例2
种子培养基胰蛋白胨10g,酵母粉10g， 60%乳酸钠16.7ml, K2HP04 0. 25g, MnS040. 005g，加蒸馏水至1000ml, pH7. 0
发酵培养基胰蛋白胨10g，酵母提取物10g,乳糖20g， K2HPO40.25g， MnSO40. 005g，琼脂20g，加蒸馏水至lOOOml， pH7. 0
将保藏号为ATCC 4874的特氏丙酸杆菌接种于种子培养基中30'C培养 48h得到种子液，将种子液按照发酵体积的4%接种量接入冷却后的发酵培 养基中，3(TC培养5d后得到含有细菌素的抗菌代谢产物。将得到的发酵液， 进行旋转蒸发，使体积缩小到原来的1/5，然后后冷冻干燥机上进行冷冻干 燥，到水分完全升华为止，得到发酵液的干粉后4 。C密封保存。
实施例3
种子培养基胰蛋白胨10g，酵母粉10g, 60%乳酸钠16.7ml， K2HP04 0. 25g， M跳O. 005g,加蒸馏水至1000ml， pH7. 0
发酵培养基玉米浆10g，酵母提取物10g，蔗糖30g， K2HPO40.25g， M载O. 005g，琼脂20g，加蒸馏水至lOOOml, pH7. 0
将保藏号为ATCC 4874的特氏丙酸杆菌接种于种子培养基中30匸培养 48h得到种子液，将种子液按照发酵体积的5%接种量接入冷却后的发酵培 养基中，3(TC培养6d后得到含有细菌素的抗菌代谢产物。将得到的发酵液， 进行旋转蒸发，使体积缩小到原来的1/6,然后后冷冻干燥机上进行冷冻干 燥，到水分完全升华为止，得到发酵液的干粉后4 。C密封保存。
实施例4
种子培养基胰蛋白胨10g,酵母粉10g， 60%乳酸钠16. 7ml， K2HP04 0. 25g， MnS040. 005g,加蒸馏水至lOOOml， pH7. 0
发酵培养基玉米浆10g，酵母提取物"g，乳糖"g， K2HPO40.25g， MnS040. 005g,琼脂20g,加蒸馏水至1000ml, pH7. 0
将保藏号为ATCC 4874的特氏丙酸杆菌接种于种子培养基中3(TC培养48h得到种子液，将种子液按照发酵体积的5%接种量接入冷却后的发酵培 养基中，3(TC培养6d后得到含有细菌素的抗菌代谢产物。将得到的发酵液, 进行旋转蒸发，使体积缩小到原来的1/6，然后后冷冻干燥机上进行冷冻干 燥，到水分完全升华为止，得到发酵液的干粉后4 。C密封保存。
实施例5
种子培养基胰蛋白胨10g，酵母粉10g， 60%乳酸钠16.7ml, K2HP04 0. 25g， MnS040. 005g，加蒸馏水至1000ml, pH7. 0
发酵培养基胰蛋白胨5g，酵母提取物15g，乳糖30g, K2HPO40. 25g, MnSO40. 005g,琼脂20g,加蒸馏水至lOOOml， pH7. 0
将保藏号为ATCC 4874的特氏丙酸杆菌接种于种子培养基中3(TC培养 48h得到种子液，将种子液按照发酵体积的5%接种量接入10L发酵罐的 6500ml发酵培养基中，3(TC培养4d后得到含有细菌素的抗菌代谢产物。将 得到的发酵液，进行旋转蒸发，使体积缩小到原来的1/3，然后后冷冻干燥 机上进行冷冻干燥，到水分完全升华为止，得到发酵液的干粉后4 。C密封 保存。
所述内容仅为本发明构思下的基本说明，而依据本发明的技术方案所 作的任何等效变换，均应属于本发明的保护范围。
权利要求
1. 一种特氏丙酸杆菌细菌素抗菌代谢物的制备方法，包括下列步骤a. 培养特征特氏丙酸杆菌菌株(Propionibacterium.thoenii)保藏于美国模式典型物收集中心(ATCC)，保藏编号ATCC4874，该菌培养于SLB固体培养基中，形成小而突起菌落.呈奶油色、黄色、橙色或深红色，培养温度30～37℃；b. 特氏丙酸杆菌的活化安瓿管开封后，用无菌吸管，吸取0.3～0.5ml适宜的液体培养基，滴入安瓿管内，轻轻振荡，使特氏丙酸杆菌菌体溶解呈悬浮状，取0.1～0.2ml菌体悬浮液，注入SLB液体培养基内，然后30℃静止深层培养48h，培养物即可用做发酵种子；c. 特氏丙酸杆菌的发酵接种量2～8％(v/v)，发酵温度29.5℃～30.5℃，发酵的碳源由葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖或麦芽糖中的任何一种或一种以上组成，碳源用量为培养基的2～4％(w/v)，氮源由胰蛋白胨、酵母粉、玉米浆、酵母提取物、乳酸钠中的任何一种或一种以上组成，氮源用量为培养基的2～3％(w/v)，无机盐由K2HPO4、KH2PO4、MnSO4中的任何一种或一种以上组成，无机盐用量为培养基的0.05～0.30％(w/v)，琼脂用量为培养基的0.5～3％(w/v)，其余为水，密闭厌氧发酵4～6天，即可得到所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物。
2. 权利要求1所述特氏丙酸杆菌细菌素抗菌代谢物的制备方法，其特 征是步骤c得到的含有所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物的发酵液 进一步旋转蒸发或超滤，使体积浓缩到原来的1/3-1/6,然后在冷冻干燥机上进行冷冻干燥，预冻温度为-45。C，干燥温度设为-2(TC，干燥12-24h 直到水分完全升华为止，得到所述特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物的干粉，4x:密封保存。
3.权利要求1或2制备的特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物在食品防 腐保鲜，消毒剂，抗感染药物，动植物病害防治和医药领域中用于抑制革 兰氏阴性菌，霉菌和酵母菌的应用。
全文摘要
本发明公开了一种特氏丙酸杆菌细菌素抗菌代谢物的制备方法，所述特氏丙酸杆菌菌株(Propionibacterium.thoenii)保藏于美国模式典型物收集中心(ATCC)，保藏编号ATCC 4874，本发明通过微生物发酵技术对所述的特氏丙酸杆菌进行活化、发酵得到含有特氏丙酸杆菌细菌素的抗菌代谢物。本发明在食品防腐保鲜，消毒剂，抗感染药物，动植物病害防治和医药领域中可用于抑制革兰氏阴性菌，霉菌和酵母菌。其制备方法操作方便，生产成本低，应用前景广阔。
文档编号C12P21/00GK101445820SQ200810201678
公开日2009年6月3日 申请日期2008年10月24日 优先权日2008年10月24日
发明者晗 冯, 常忠义, 荣绍丰, 贾彩凤, 陈玉梅, 马悦培, 高红亮 申请人:上海应用技术学院