专利名称：：番红花病毒检测方法
技术领域：
：本发明涉及生物检测技术，具体涉及番红花病毒检测方法。
背景技术：
：番红花(CrocussativusL.)又名藏红花、西红花，系鸢尾科(Iridaceae)番红花属多年生草本植物。原产南欧各国及伊朗等地，后经印度转入西藏再传入中国，引种栽培成功，故又名藏红花或西红花。由于番红花只是柱头入药，产量极低，采收耗时费力；同时种源少，适宜栽培地区有限、条件苛刻等因素致使其价格昂贵，在我国被列为珍惜名贵的中药材，并被誉为"植物黄金"。其雌蕊柱头是名贵中药，具有活血化瘀、凉血解毒、解郁安神之功效，是传统的妇科、伤科良药。临床上还主要用于胃病、调经、麻疹、发热、肝脾肿大等的治疗。尤其是近年来在治疗心脑血管疾病方面取得了较好的疗效。中国藏红花的栽培品种主要来自于德国和日本，在田间种植23年后均严重退化，叶片出现黄色条斑，整株矮化、黄化，顶端枯死，提前倒苗，球茎畸小，柱头产量大大降低。国内外报道其病源为芜菁花叶病毒(turnipmosaicvirus,TuMV)、鸢尾花叶病毒(irismosaicvirus,IMV)、菜豆黄花口十病毒(beamyellowmosaicvirus,ByMV)、黄瓜花口十病毒(cu2固bermosaicvirus,CMV)及烟草脆裂病毒(tobaccorattlevirus,TRV)，其中T薩、MV和ByMV属于马铃薯Y病毒(potyvirus)。经田间调查和病毒学鉴定，导致藏红花花品质衰退、产量递减的植物病源是TuMV，这种病毒对藏红花的危害巨大，发生面积大，田间发病率为70%97%。因而检测和发现番红花病毒很重要，但现有检测方法不太方便，例如指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和总核酸提取法等，有一定局限性。
发明内容本发明要解决的技术问题在于克服上述不足之处，提供一种快速、灵敏、特异的检测番红花病毒的方法。本发明提供了一种番红花病毒检测方法，根据番红花易感CMV(黄瓜花叶病毒)，TuMV(芜菁花叶病毒)，PVY(马铃薯Y病毒)，TRV(烟草脆裂病毒)病毒核苷酸序列设计的特异性引物，提取植物组织的总RNA后，采用RT-PCR的方法，检测番红花病毒。该方法包括下列步骤1、引物设计根据番红花病毒的核苷酸序列设计了扩增番红花病毒外壳蛋白的特异性引物。根据已报道的病毒的CMV、PVY、TuMV、TRV核苷酸序列设计了扩增病毒的特异性引物，引物序列如下表1番红花病毒检测用弓I物<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>2、总RNA提取1)处理取O.2g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈振荡摇匀；2)RNA分离4t:，12000rpm离心10min以除去不溶的成分，将上清液转入一新的1.5ml离心管中；3)RNA提取室温下保持5min，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持10min后，4。C，12000rpm离心15min;4)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，室温下静置15min。4°C，12000rpm离心15min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；5)RNA洗涤弃去上清液，加入75%的乙醇洗涤；混匀，4°C，12000rpm离心5min;6)弃去乙醇，沉淀于室温下自然晾干，RNA溶于40uldH20中，保存于-70°〇备用。3、RT-PCR扩增l)反转录合成cDNA反转录以植物总RNA为模板，进行反转录合成cDNA，其反应体系为3.OuLRNA、2.OuL5XRT缓冲液、1.OuLdNTP/10mM、0.5uLRNA酶抑制剂(40U/uL)、0.5uL反转录酶XL(AMV)(5U/uL)、0.5uL引物禾口2.5uLdH20。混合均匀后，室温放置10min，45。C水浴lh。2)PCR扩增聚合酶链式反应以反转录产物为模板，用表1中的引物，进行聚合酶链式反应，其反应体系如下。聚合酶链式反应的体系为2.0uL反转录产物、2.5uLlOXTaq缓冲液、1.OuLdNTP/10mM、0.5uLTaqDNA聚合酶、0.5uL上游引物、1.5uL下游引物和18uL叫0，其反应条件见表2。表2PCR扩增的条件病毒扩增条件TuMV(芜菁花叶病毒)94°C5min,l个循环;94。C30s,48°C30s，72°Clmin,3个循环;94。C30s，51。C30s,72。Clmin，30个循环;72。C10min,l个循环;4。C保温TRV(烟草脆裂病毒)94°C5min,l个循环;94。C30s，48。C30s，72。Clmin，3个循环;94。C30s，49。C30s，72。Clmin,30个循环;72。C10min，l个循环；4'C保温CMV(黄瓜花叶病毒)94°C5min，l个循环;94。C30s，50。C30s,72。Clmin,3个循环；94。C30s,53。C30s,72。Clmin，30个循环;72。ClOmin,l个循环；4i:保温Potyvirus(马铃薯Y病毒)94°C5min,l个循环；94°C30s，50°Clmin,72。Clmin，3个循环；94。C30s，53。Clmin，72。Clmin,30个循环;72'C10min，l个循环；4'C保温4、电泳检测取5uLPCR产物经0.8%-1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，其反应体系为4.5uL标物，2.0uLlOXloadingbuffer,7.OuLPCR产物，120V电压。电泳结束后将凝胶于10ug/uL溴化乙锭中染色15min，于凝胶成像仪中观察并记录结果。本发明能有效克服指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和总核酸提取法的缺点，方便、特异、灵敏的检测番红花病毒。具体实施例方式实施例1:以已知的感染番红花病毒的植株为检测材料，并以未感染病毒的健康材料为阴性对照。1.引物设计和合成根据已报道的病毒的CMV、PVY、TuMV、TRV核苷酸序列设计了扩增病毒的特异性引物，引物序列如下表1番红花病毒检测用弓I物<table>tableseeoriginaldocumentpage0</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>2.总RNA的提取1)处理取O.2g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈振荡摇匀；2)RNA分离4°C，12000rpm离心lOmin以除去不溶的成分，将上清液转入一新的1.5ml离心管中；3)RNA提取室温下保持5min，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持lOmin后，4。C，12000rpm离心15min;4)将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，室温下静置15min。4°C，12000rpm离心15min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；5)RNA洗涤弃去上清液，加入75%的乙醇洗涤；混匀，4°C，12000rpm离心5min;6)弃去乙醇，沉淀于室温下自然晾干，RNA溶于40uldH20中，保存于-70°〇备用。3.RT-PCR扩增方法的建立1)反转录合成cDNA反转录以植物总RNA为模板，进行反转录合成cDNA，其反应体系为3.OuLRNA、2.OuL5XRT缓冲液、1.OuLdNTP/10mM每、0.5uLRNA酶抑制剂(40U/uL)、0.5uL反转录酶XL(AMV)(5U/uL)、0.5uL引物禾口2.5uLdH20。混合均匀后，室温放置10min，45。C水浴lh。2)PCR扩增聚合酶链式反应以反转录产物为模板，用表3中的引物，进行聚合酶链式反应，其反应体系如下。聚合酶链式反应的体系为2.0uL反转录产物、2.5uLlOXTaq缓冲液、1.OuLdNTP/10mM、0.5uLTaqDNA聚合酶、0.5uL上游引物、1.5uL下游引物和18uLdH20。4.电泳检测取5uLPCR产物经0.8%-1.5%琼脂糖凝胶中进行电泳，其反应体系为4.5uL标物，2.OuL10Xloadingbuffer,7.OuLPCRproducts,120V电压。电泳结束后将凝胶于10ug/uL溴化乙锭中染色15min，于凝胶成像仪中观察并记录结果。权利要求一种番红花病毒检测方法，其特征在于该检测方法包括下列步骤(1)引物设计根据番红花病毒的核苷酸序列设计扩增番红花病毒外壳蛋白的特异性引物，引物序列；(2)总RNA提取①处理取0.2g发病叶片，剪成小段，用液氮研磨成粉末状，移入灭菌的1.5ml离心管中，然后加入1ml的Trizol试剂，剧烈振荡摇匀；②RNA分离4℃，12000rpm离心10min以除去不溶的成分，将上清液转入一新的1.5ml离心管中；③RNA提取室温下保持5min，加0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，然后在室温下保持10min后，4℃，12000rpm离心15min；④将上层水相转移到新的1.5ml离心管中，加0.5ml异丙醇，室温下静置15min。4℃，12000rpm离心15min，RNA就会在管的侧壁和底部形成沉淀；⑤RNA洗涤弃去上清液，加入75％的乙醇洗涤；混匀，4℃，12000rpm离心5min；⑥弃去乙醇，沉淀于室温下自然晾干，RNA溶于40uldH2O中，保存于-70℃备用；(3)RT-PCR扩增①反转录合成cDNA反转录以植物总RNA为模板，进行反转录合成cDNA，其反应体系为3.0uLRNA、2.0uL5×RT缓冲液、1.0uLdNTP/10mM、0.5uLRNA酶抑制剂40U/uL、0.5uL反转录酶XL(AMV)5U/uL、0.5uL引物和2.5uLdH2O，混合均匀后，室温放置10min，45℃水浴1h；②PCR扩增聚合酶链式反应以反转录产物为模板，用步骤(1)设计的引物，进行聚合酶链式反应，其反应体系如下，聚合酶链式反应的体系为2.0uL反转录产物、2.5uL10×Taq缓冲液、1.0uLdNTP/10mM、0.5uLTaqDNA聚合酶、0.5uL上游引物、1.5uL下游引物和18uLdH2O；(4)电泳检测取5uLPCR产物经0.8％-1.5％琼脂糖凝胶中进行电泳，其反应体系为4.5uL标物，2.0uL10×loadingbuffer，7.0uLPCR产物，120V电压，电泳结束后将凝胶于10ug/uL溴化乙锭中染色15min，于凝胶成像仪中观察并记录结果。2.根据权利要求l所述的番红花病毒检测方法，其特征在于步骤(1)根据番红花病毒的CMV核苷酸序列设计了扩增病毒的特异性引物为CMV(+)ATGGACAAATCTGAATCACCC;CMV(-)TAAGCTGGATGGACAACCCGT。3.根据权利要求l所述的番红花病毒检测方法，其特征在于步骤(1)根据番红花病毒的PVY核苷酸序列设计了扩增病毒的特异性引物为PVY(+)GGNAAYAAYAGYGGNCARCC;PVY(-)CAGGATCCAAGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT。4.根据权利要求l所述的番红花病毒检测方法，其特征在于步骤(1)根据番红花病毒的TuMV核苷酸序列设计了扩增病毒的特异性引物为TuMV(+)GTGGCTTTAAACCTCGATCA;TuMV(-)ACGCCAAGTAAGTTATGCAT。5.根据权利要求l所述的番红花病毒检测方法，其特征在于步骤(1)根据番红花病毒的TRV核苷酸序列设计了扩增病毒的特异性引物为TRV(+)GCTATGAAATTTGCGTTACA;TRV(-)TTATGATACGCAGTAGAAGC。6.根据权利要求l所述的番红花病毒检测方法，其特征在于步骤(3)PCR扩增中的循环次数为30-35次；PCR扩增的条件为病毒扩增条件TuMV(芜菁花叶病毒)94°C5min，1个循环；94。C30s，48°C30s，72°Clmin，3个循环；94°C30s，51。C30s，72。Clmin，30个循环；72。C10min，1个循环；4。C保温；TRV(烟草脆裂病毒)94°C5min，1个循环；94。C30s，48°C30s，72°Clmin，3个循环；94°C30s，49。C30s，72。Clmin，30个循环；72。C10min，1个循环；4。C保温；CMV(黄瓜花叶病毒)94°C5min，1个循环；94。C30s，50。C30s，72。Clmin，3个循环;94°C30s，53。C30s，72。Clmin，30个循环；72。C10min，1个循环；4。C保温；Potyvirus(马铃薯Y病毒)94°C5min，1个循环；94。C30s，50。Clmin，72。Clmin，3个循环；94。C30s，53。Clmin，72。Clmin，30个循环；72。C10min，1个循环；4。C保温。7.根据权利要求l所述的番红花病毒检测方法，其特征在于步骤(4)电泳检测时所用的琼脂糖凝胶浓度为0.8-1.0%。全文摘要本发明公开了一种番红花病毒检测方法，根据CMV，TuMV，PVY，TRV病毒核苷酸序列设计了特异性引物，提取番红花组织的总RNA后，采用RT-PCR的方法，检测番红花病毒。本发明能有效克服指示植物法、电镜技术、酶联免疫技术和总核酸提取法的缺点，方便、特异、灵敏的检测番红花病毒。文档编号C12Q1/70GK101724710SQ200810201020公开日2010年6月9日申请日期2008年10月10日优先权日2008年10月10日发明者吴威巍,杨弘,秦路平,韩婷申请人:上海华宇药业有限公司