抗cd20抗体片段与力达霉素的融合蛋白、制备方法及其用途的制作方法

专利名称：抗cd20抗体片段与力达霉素的融合蛋白、制备方法及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤学和生物药学领域。具体而言，本发明提供了可以产生靶向肿瘤 杀伤作用的融合蛋白、其制备方法及其用途，进而为肿瘤的靶向治疗提供了优良的候选药 物。
背景技术：
非霍奇金淋巴瘤(NHL)是一种起源于淋巴组织的恶性肿瘤，其发病率和死亡率已 居恶性肿瘤第5位。常规的放疗和化疗虽然对NHL有效率较高，但选择性差，在杀伤肿瘤细 胞的同时也可能损害体内某些类型的正常细胞，常出现较明显的毒副反应，因此肿瘤靶向 治疗已成为提高治疗效果的一条重要途径。在肿瘤靶向治疗中，靶向治疗的靶点选择非常重要，已知大多数NHL起源于B淋巴 细胞，95%以上的B细胞NHL表达⑶20抗原，而⑶20又仅在前B淋巴细胞、未成熟B淋巴 细胞、成熟B淋巴细胞、激活B淋巴细胞中表达；在浆细胞、淋巴多能干细胞以及其它组织均 无表达，且⑶20抗原比较暴露，人体血清中也无游离的⑶20存在，因此⑶20可作为治疗B 细胞淋巴瘤的有效靶点。在靶向治疗中使用最多的是与肿瘤相关抗原相关的单克隆抗体。自从1997年美 国FDA批准抗CD20人鼠嵌合抗体利妥昔抗体(Rituximab)上市，人们对抗体药物产生了极 大的期望，另外，最近利用抗CD20抗体治疗自身免疫性疾病如类风湿性关节炎，系统性红 斑狼疮等成为新的研究热点，这也提示抗CD20抗体的治疗应用范围将进一步得到扩展。但 随着使用单抗进行治疗的病例数的增加，药物抗性的问题也越来越明显。随之发展起来的 mI标记的抗⑶20鼠源性抗体Bexxar和9°Y标记的Zevalin抗体，作用机制与利妥昔抗体 不同，克服了药物抗性，但免疫原性大，只能一次注射，且毒副反应大，患者耐受性差。因此 研制以CD20为靶点的小型、高效的抗体靶向药物成为当务之急。发明简述针对这种现状，申请人设想采用小型化抗CD20抗体片段(靶向载体)与强效抗肿 瘤药物(弹头)相结合的策略。在进行小型化抗体片段选择时，申请人选择了抗CD20抗体Fab片段和抗CD20抗 体的scFv片段作为靶向载体。其中Fab片段是由重链可变区VH、恒定区中的CHl和轻链 可变区VL、恒定区CL组成，单链抗体(scFv)是由抗体分子中的重链可变区VH和轻链可变 区VL通过连接肽(通常为[GlySer4]3)连接而成，它们均具有分子量小、穿透力强、体内半 衰期短以及易于基因改造和可通过细菌发酵大量生产等优点。而且由于Fab、scFv分子量 小，免疫原性小而不易产生HAMA反应，且易穿透致密的肿瘤细胞间隙屏障，可进入实体瘤 深部；同时它们均缺乏Fc片段，避免了 Fc介导的受体结合作用，使得其快速向靶部位集中； 此外还易于在体外进行基因改造，通过基因重组技术，在编码Fab、scFv基因后面连接上活 性蛋白基因，并在受体中表达，产生靶向融合蛋白。因此抗体Fab片段及scFv作为肿瘤靶向药物的载体具有诱人的前景。在进行“弹头”选择时，申请人选择了高活性的“弹头”药物力达霉素(LDM)， 亦称C-1027或C1027，是从中国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株由球孢链霉菌 (Streptomyces globisporus，菌种保藏编号CGMCC No. 0704)产生的烯二炔类抗生素，是 迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。LDM由两部分分子组 成一为烯二炔结构的发色团(active enediyne, AE)，具有细胞毒作用，但不稳定；另一为 110个氨基酸残基组成的辅基蛋白(LDP)，对发色团的稳定起保护作用。发色团和辅基蛋白 通过非共价键结合，两者结合具有特异性和牢固性，LDM的辅基蛋白和发色团可以拆分和进 行分子重建。LDM以其独特的分子结构适合作为“弹头”药物。申请人:通过基因工程方法，从含有抗⑶20抗体的重组质粒pCANTAB5E Fcd20Fab' 中扩增得到CHl片段，从质粒pET30Sngrldp (保藏号CGMCCNo. 2010)中扩增得到LDP基因， 然后通过SOE-PCR得到Fab-LDP基因，然后将该片段重新组装到切除了 CHl基因的质粒 pCANTAB 5E Fcd20Fab，中，得到含有Anti_CD20 (Fab)-LDP的质粒，将该质粒转导到表达宿 主菌株中，通过改变培养温度、培养基成分和培养时间优化培养条件，获得了可溶性表达的 Fab-LDP融合蛋白，将该融合蛋白与AE分子重新组装，得到强化融合蛋白Fab-LDM，在动物 试验中，本发明的强化融合蛋白Fab-LDM保留了抗CD20抗体的靶向性和LDM的杀伤活性， 相较相同剂量的Fab、LDM，本发明的Fab-LDM表现出更高的肿瘤抑制效果。同时，申请人同样以基因工程手段，从含有抗⑶20抗体的重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab'中扩增得到VH、VL片段，通过SOE-PCR获得scFv基因片段，将该基因与LDP基 因同时连接到质粒PGEMT中，获得pGEMT-scFv-LDP，然后从该质粒中双酶切获得scFv-LDP 基因，然后将scFv-LDP连接到表达质粒pCANTAB 5E中，得到融合了抗⑶20抗体的scFv 片段与LDP片段的质粒，将该质粒转导到表达宿主菌株中，通过改变诱导物浓度和培养时 间等优化培养条件，获得了主要以包涵体形式表达的scFv-LDP融合蛋白，经过变性和复性 的融合蛋白与AE分子重新组装，得到强化融合蛋白scFv-LDM，在动物试验中，本发明的强 化融合蛋白scFv-LDM保留了抗CD20抗体的靶向性和LDM的杀伤活性，相较相同剂量的 scFv-LDP和LDM，本发明的scFv-LDM表现出显著的肿瘤抑制效果。由此提供了新型的、由 抗CD20抗体片段和力达霉素融合而成的可用于肿瘤治疗候选靶向肿瘤治疗药物。


图Ia为重组表达质粒pCANTAB 5E_Fab_LDP的限制性内切酶分析结果，其中，1为 DNA 分子量标准；2 为重组质粒 pCANTAB 5E_Fab_LDP/apaI+sphI。图Ib为重组表达质粒pCANTAB 5E-scFv-LDP的限制性内切酶分析结果，其中，1 为 DNA 分子量标准(DL15000)；2 为重组质粒 PCANTAB 5E-scFv_LDP ；3 为 pCANTAB 5E-scFv_LDP/MluI+XhoI ；4 为 pCANTAB 5E-scFv_LDP/MluI+EcoRI ；5 为 pCANTAB 5E-scFv_LDP/EcoR I+XhoI ；6 为 DNA 分子量标准(DL2000)。图2a为融合蛋白Fab-LDP表达产物的SDS-PAGE分析结果，其中，
1为低分子量蛋白标准；2为重组菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周质腔蛋白非还原纯化后；3为重组菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周质腔蛋白非还原流出液；4为重组菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周质腔蛋白非还原上样前；5为重组菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周质腔蛋白还原纯化后；6为重组菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周质腔蛋白还原流出液；7为重组菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周质腔蛋白还原上样前。图2b为融合蛋白 Fab-LDP表达产物的Western印迹分析结果，其中，1为重组菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周质腔蛋白非还原上样前；2为LDP阳性对照；3为重组菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周质腔蛋白非还原纯化后；4为重组菌株pCANTAB 5E_Fab_LDP周质腔蛋白非还原流出液。图2c为融合蛋白 scFv-LDP在重组菌株中的诱导表达结果，其中，1为低分子量蛋白标准；2为重组菌株pCANTAB 5E表达的全菌蛋白；3为重组菌株pCANTAB 5E-scFv_LDP经诱导后的全菌蛋白。图2d为融合蛋白scFv-LDP表达产物的SDS-PAGE和Western印迹分析结果，其中，1为低分子量蛋白标准2为重组菌株pCANTAB 5E_scFv-LDP经诱导后的全菌蛋白3为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的培养基上清组分4为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的细胞周质腔组分5为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的可溶性细胞质组分6为重组菌株pCANTAB 5E-scFv_LDP经诱导后的不可溶包涵体组分图2e为融合蛋白scFv-LDP经金属螯合层析纯化的SDS-PAGE分析结果，其中，1为低分子量蛋白标准；2为重组菌株pCANTAB 5E-scFv-LDP经诱导后的全菌蛋白；3为不可溶包涵体的样品预处理；4-7为不与亲和层析柱结合的杂蛋白；8-10为经洗脱缓冲液洗脱下来的融合蛋白scFv-LDP。图3a为抗⑶20Fab和Fab-LDP与Raji细胞的结合活性的FACS分析结果，其中， ▼代表 Fab-LDP ； □代表抗 CD20Fab图3b为融合蛋白scFv-LDP对Raji细胞的免疫反应性分析结果。其中， 代表2X IO5个Raji细胞；■代表1 X IO5个Raji细胞；▲代表 0. 5X IO5 个 Raji 细胞。图3c为融合蛋白scFv-LDP对Daudi细胞的免疫反应性分析结果。其中， 代表 2 X IO5个Daudi细胞；■代表IX IO5个Daudi细胞；▲代表 0. 5 X IO5 个 Daudi 细胞。图4a表示强化融合蛋白Fab-LDM与LDM对Raji细胞的细胞毒作用，其中， 代表Fab-LDM ； □代表 LDM。
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图4b表示强化融合蛋白Fab-LDM与LDM对Daudi细胞的细胞毒作用，其中， 代表LDM ； □代表 Fab-LDM。图4c表示强化融合蛋白Fab-LDM与LDM对K562细胞的细胞毒作用，其中，▲代表LDM ； □代表 Fab-LDM。图4d表示强化融合蛋白Fab-LDM与LDM对不同细胞的IC50的比较，其中，□代表LDM ；代表 Fab-LDM。图4e表示强化融合蛋白scFv-LDM与LDM对Raji细胞的细胞毒作用，其中，■代表LDM ； 代表 s cFv-LDM。图4f表示强化融合蛋白scFv-LDM与LDM对Daudi细胞的细胞毒作用，其中， 代表LDM ； 代表 scFv-LDM图5a表示强化融合蛋白Fab-LDM对早期裸鼠移植性⑶20+B细胞淋巴瘤模型的治 疗作用，其中， 代表 PBS; 代表抗 CD20Fab 4pmol/kg ；▲代表 Fab-LDM 2pmol/kg ； 代表 LDM 4pmol/kg ；▼代表 Fab-LDM 4pmol/kg ；〇代表 LDM 2pmol/kg。图5b表示强化融合蛋白Fab-LDM对晚期裸鼠移植性⑶20+B细胞淋巴瘤模型的治 疗作用。其中， 代表 PBS;〇代表抗 CD20Fab 4pmol/kg ； 代表 Fab-LDM 2pmol/kg ； 代表 LDM 4pmol/kg ；▲代表 Fab-LDM 4pmol/kg ；▼代表 LDM 2pmol/kg。图5c表示强化融合蛋白scFv-LDM对裸鼠移植性⑶20+B细胞淋巴瘤模型的治疗 作用。其中， 代表 PBS;X 代表 LDM 0. 05mg/kg ；※代表 scFv-LDM 0. 3mg/kg ；參代表 scFv-LDM 0. 2mg/kg ；▲代表 scFv-LDM 0. lmg/kg。发明详述在本发明中所提及的术语均按下述定义来理解。在本文中提到的“LDM”等同于“LDP-AE”、“力达霉素”、“力达霉素辅基蛋白，其中 辅基蛋白上结合有发色团AE”。发色团和辅基蛋白通过非共价键结合，两者结合具有特异性 和牢固性，LDM的辅基蛋白和发色团可以拆分和进行分子重新组装。在本文中提到的“AE”是指具有下式I所示的化学结构的发色团，
LDM发色团的化学名(2R，7S，9R，10R) _7_ 氨基-7,8- (2*-氯 _6*_ 羟基-1*，4*-亚苯基)-10- (4，-去 氧-4，-二甲氨基_5，，5，-二甲基-吡喃核糖基)-4，8_氧杂-5-氧代-1，11，13-三烯-15， 18- 二炔-三环[7，7，3，O10,14]-2-十九碳醇-2”，3”- 二氢-7”-甲氧基-2”-亚甲基-3”-氧 代-1”，4”-苯并恶嗪-5”-羧酸酯。分子式=C43H42O13N3Cl力达霉素发色团结构式(I)其由野生型力达霉素生产菌产生，天然地结合于力达霉素的辅基蛋白上，而且可 以通过在低温条件下用冷甲醇等有机溶剂处理力达霉素的方式得到游离状态的发色团AE， 该游离的发色团AE可以与去除了 AE的力达霉素辅基蛋白LDP或者基因工程产生的LDP (其 上可以融合有其它蛋白片段或者不融合有其它蛋白片断)在低温条件下组装成与天然力 达霉素形式相同的活性形式，这种重新组装被称为“强化”。在本文中提到的“Fab”等同于“Anti_CD20 (Fab)、“抗CD20Fab”、“抗CD20抗体的 Fab片段”、“SEQ ID NO 1 所示的第24-467位所示的抗CD20抗体Fab片段”。在本文中提到的“Fab-LDP”等同于“antiCD20 (Fab)-LDP”、“抗CD20抗体的Fab片 段与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白”、“ SEQ IDNO 1所示的融合蛋白。在本文中提到的“scFv”等同于、“抗⑶20抗体的单链抗体片段”、 “antiCD20 (scFv) ”、“SEQ ID NO 2 的第 24-266 位所示的抗 CD20 抗体 scFv 片段”。在本文中提到的“scFv-LDP”等同于“anti-CD20(scFv)_LDP”、“抗CD20抗体的单 链抗体片段与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白”、“SEQ ID NO :2所示的融合蛋白”。在本文中提到的“Fab-LDM”等同于“强化融合蛋白 Fab-LDM" “antiCD20 (Fab)-LDP-AE”、“抗 CD20 抗体的 Fab 与力达霉素的融合蛋白”、“SEQ ID NO 1所示的融合蛋白，其中力达霉素霉素辅基蛋白上结合有发色团AE”。在本文中提到的“scFv-LDM”等同于“强化融合蛋白scFv_LDM”“antiCD20 (scFv)-LDP-AE”、“抗CD20抗体的单链抗体与力达霉素辅基蛋白的融合蛋白，其中辅基蛋白上结合 有发色团AE”、“抗⑶20抗体的单链抗体与力达霉素的融合蛋白” “SEQ ID NO :2所示的融 合蛋白，其中力达霉素霉素辅基蛋白上结合有发色团AE”。具体地，本发明了提供了下述内容1.融合蛋白，其选自下述序列之一
(a)由SEQ ID NO :1或3所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO :1或3所示的氨基酸序列的生物学功能、且与SEQ ID NO 1 或者3所示的氨基酸序列具有95%以上同源性的氨基酸序列构成的氨基酸序列；和(c)具有SEQ ID NO :1或3所示的氨基酸序列的生物学功能，且经过取代、缺失或 添加一个或几个氨基酸的SEQ ID NO :1或3所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列。2.项目1的融合蛋白，其还功能性地结合有式⑴所示结构的发色团AE 力达霉素发色团结构式(I)3.核酸分子，其编码项目1的融合蛋白的基因，其选自下述序列之一(a) SEQ ID NO 2所示的编码SEQ ID NO 1的核苷酸序列；(b)SEQ ID NO 4所示的编码SEQ ID NO 3的核苷酸序列；(c)编码项目1中(b)的氨基酸序列的核苷酸序列；(d)编码项目1中(C)的氨基酸序列的核苷酸序列；和(e)因为密码子简并性而分别与SEQ ID NO 2和4不同、但是编码与SEQ ID NO 2或4所示序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列。4.载体，其可操作地连接有项目3所述的核酸分子。5.项目4的载体，所述载体是质粒。6.宿主菌，其包含项目4所述的载体。7.项目6的宿主菌，其是保藏号为CGMCC No. 3125，于2009年06月17日送交中 国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的名为IHPAYZ的大肠埃希氏菌。8.项目6的宿主菌，其是保藏号为CGMCC No. 3100，于2009年06月17日送交中 国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的名为IMBPAYZ的大肠埃希氏菌。9.制备项目2的融合蛋白的方法，包括以下步骤(a)将抗⑶20抗体的Fab基因与力达霉素辅基蛋白LDP基因可操作地连接到质 粒pCANTAB 5E中，得到重组表达质粒pCANTAB5E_Fab_LDP，或者将抗CD20抗体的可变区单 链scFv基因与力达霉素辅基蛋白LDP基因可操作地连接到质粒pCANTAB 5E中，得到重组 表达质粒 pCANTAB 5E-scFv-LDP,(b)在大肠杆菌HB2151中的诱导表达融合蛋白Fab-LDP、scFv-LDP，(c)纯化及其复性步骤(b)中获得的融合蛋白，
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(d)使步骤(C)中获得的融合蛋白与式(I)的发色团组装，(e)任选地，其还包括测定步骤(d)中组装后的融合蛋白的生物学活性的步骤。10.药物组合物，其中含有药学有效量的项目1或者2所述的融合蛋白，任选地，还 含有药学上允许的佐剂。11.项目1或者2的融合蛋白在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的用途。12.项目11的用途，所述药物用于靶向杀伤淋巴瘤细胞。13.项目11的用途，其中的淋巴瘤是裸鼠淋巴瘤或者人B细胞淋巴瘤。下面通过实施例对本发明的具体实施方式
进行阐述，所述的实施方式仅仅用来解 释和说明本发明，其并不限制本发明的保护范围。任何本领域技术人员根据公知的知识和 现有技术的教导能够想到的等价的变体都包含在本发明的保护范围中。
具体实施例方式实施例11.重组表汰质粒 dCANTAB 5E-antiCD20Fab-LDP 的构津PCR 扩增 CHl:由于重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab，含有抗CD20单抗HI47的VH、VL及人源化 CL、CH1基因，且重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab，只有CHl区含有一个apal酶切位点，所以 申请人:用含有Fab，基因的重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab，(Inhibition of human B-cell lymphoma by ananti-CD20antibody and its chimeric(Fab')2fragment via inductionof apoptosis. YinxingLiu, ZhenpingZhu et. al. Cancer Letters205 (2004) 143-153)作为模 版，获得CHI。PCR引物由上海英骏公司合成，分别引入相应酶切位点。具体地，以pCANTAB 5E Fcd20Fab'做为模板，用Pl作为5，端引物，P2作为3，端 引物，进行PCR扩增，反应条件为94°C预变性5分钟，然后94°C变性1分钟，56°C退火1分 钟，72°C延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72°C延伸10分钟。得到以apal酶 切位点开头的部分CHl的基因片段A(约324bp)。将片段A进行1.5%琼脂糖凝胶电泳，并 用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。Anti_CD20Fab，上游引物 Pl 5，-GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCC-3‘ (SEQ ID No 5)apal酶切位点Anti_CD20Fab，下游引物 P2 5， -CGCGCTGCCACCGCCACCTGTGTGAGTTTTGTCACAAGA-3， (SEQ ID No 6)LDP上游引物P3:5，-ACAGGTGGCGGTGGCAGCGCGCCCGCCTTCTCCGTC3，(SEQ ID No 7)LDP下游引物P4:5，-GCGCGCATGCTCAGCCGAAGGTCAGAGCCAC-3‘ (SEQ ID No 8)sphl酶切位点PCR 扩增 LDP:用含有LDP基因的重组质粒pET30sngrldp(保藏号CGMCCNo. 2010)为模板，用P3 作为5’端引物，用P4作为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件94°C预变性5分钟，然后
1094°C变性1分钟，60°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72°C 延伸10分钟。得到LDP的基因片段B(约330bp)。将片段B进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳， 并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。SOE-PCR 扩增 Fab-LDP 利用纯化的片段A(CHl)和片段B(LDP)产物，进行扩增，反应条件94°C变性1分 钟，60°C退火1分钟，72°C延伸2分钟，共10个循环，然后72°C再延伸10分钟，生成少量 CHl-Iinker-LDP模板。完成上步反应后，补加Pl和P4引物，进行扩增，反应条件94°C变性 1分钟，60°C退火1分钟，72°C延伸2分钟，共30个循环，72°C再延伸10分钟。得到Fab-LDP 基因片段C (片段A+B，约669bp)，将反应产物C进行琼脂糖凝胶电泳，并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收 纯化。将回收得到的Fab-LDP片段和pCANTAB 5E Fcd20Fab，载体分别经apal、sphl酶切 后，将反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用博大泰克公司A型胶回收试剂盒回收纯化。 将得到的载体酶切产物与目的基因的酶切产物按1 6的比例用Takara公司的T4连接酶 16°C连接16个小时后，转化感受态大肠杆菌HB2151，筛选出重组克隆质粒，并进行菌液PCR 及酶切鉴定后，测序，结果表明，融合基因重组表达质粒的酶切结果和测序结果与预期完全 一致，融合蛋白的基因编码序列为669bp，序列正确，命名为pCANTAB 5E Fab-LDP,菌体PCR 产物的电泳图参见图la。其中Fab-LDP的蛋白质序列如SEQ ID NO 1所示，其中，1_23位为信号肽；24-132 位为轻链可变区；133-237位为轻链恒定区；238-359位为重链可变区；360-467位为重链 CHl区；468-472位为G4S ；473-582位为力达霉素辅基蛋白。Fab-LDP的DNA序列如SEQ ID NO 3所示，其中1_69位为信号肽基因序列， 70-396位为轻链可变区基因序列；397-711位为轻链恒定区基因序列；712-1077位为重链 可变区基因序列；1078-1401位为重链CHl区基因序列；1402-1416位为G4S ； 1417-1746位 为力达霉素辅基蛋白基因序列；1747-1752位为SphI酶切位点；1753-1755位为终止密码子。2.重组表达质粒 DCANTAB-anti-CD20scFv_LDP 的构建设计PCR引物，所述PCR引物由上海英俊公司合成，分别引入相应酶切位点。重链可变区(VH)5'端引物 PHl (SEQ ID NO 9)5， -CAAACGCGTACGCTCAGGTGAAGCTG-3’MluI重链可变区(VH)3'端引物 PH2(SEQ ID NO 10)5' -ACCGCCGGATCCACCGCCACCCGAGCCACCGCCTCCTGAGGAGACGGTGACCGTGATC-3’Linker轻链可变区(VL)5'端引物 PLl (SEQ ID NO 11)5' -GGCTCGGGTGGCGGTGGATCCGGCGGTGGCGGTTCGGACATCGAGCTCACTCAGTCTC-3’Linker轻链可变区(VL)3'端引物 PL2(SEQ ID NO 12)5， -GAGCATGCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGTGCTCGAGTTTGATCTCCACCTTGGTCCCAG-3’SphIhis6XhoI
PCR 扩增 VH、VL:以含有Fab，基因的重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab'为模板，用PHl作为5，端引 物，PH2作为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件94°C预变性5分钟，然后94°C变性1分钟， 58°C退火1分钟，72 °C延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72 °C延伸10分钟，得 到VH基因片段D (约370bp)。将得到的反应产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，并用BioDev 公司的玻璃奶试剂盒回收纯化VH片段。以含有Fab，基因的重组质粒pCANTAB 5E Fcd20Fab'为模板，用PLl作为5，端 引物，用PL2作为3’端引物，进行PCR扩增，反应条件94°C预变性5分钟，然后94°C变性 1分钟，58°C退火1分钟，72°C延伸1分钟，进行25个循环。最后一个循环后，72°C延伸10 分钟，得到VL基因片段E (约320bp)。将得到的反应产物进行1. 5%琼脂糖凝胶电泳，并用 BioDev公司的玻璃奶试剂盒回收纯化VL片段。SOE-PCR 扩增 scFv 利用纯化的VH和VL PCR产物，进行扩增，反应条件94°C变性1分钟，60°C退火1 分钟，72°C延伸2分钟，共7个循环，然后72°C再延伸10分钟，生成少量VH-Iinker-VL模 板。上步反应完后，补加PHl和PL2引物，进行PCR扩增，反应条件94°C变性1分钟，56°C 退火1分钟，72°C延伸2分钟，共25个循环。72°C再延伸10分钟。扩增得到scFv基因片 段F (约760bp)，将反应产物进行1 %琼脂糖凝胶电泳，并用BioDev公司的玻璃奶试剂盒回 收纯化scFv片段。所得到的scFv基因片段是由编码(GGGGS)3序列的spacer短肽将重链 可变区VH和轻链可变区VL连接而成的一条多肽链。将scFv按Takara公司18T载体试剂盒(产品号D504A)提供的方法与18T载体 相连，转化大肠杆菌DH5 α (上海生工，产品号SD8411)，筛选出重组克隆质粒，测序正确后 命名为18T-scFV。将质粒18T-scFV进行MluI/SphI双酶切，释放出的scFv基因片段与进 行同样双酶切的PCANTAB5E载体连接，得到scFv基因重组表达质粒pCANTAB 5E-scFv,并进 行酶切鉴定和序列鉴定。结果表明，重组表达质粒pCANTAB 5E-SCFv的酶切结果和测序结 果与预期完全一致，单链抗体基因编码序列为762bp，由254个氨基酸组成，序列正确。在scFv基因5’端引入了 MluI酶切位点，3，端引入了 SphI酶切位点，利于与 pCANTAB 5E载体连接，3’端XhoI酶切位点的设置，利于下一步LDP的连接；6个连续组氨 酸标签肽(His6-Tag)的密码子，使得下一步表达蛋白的3’端融合有His6-Tag,便于纯化和 鉴定。3.抗⑶20单链抗体scFv基因和力达霉素辅基蛋白LDP基因的克隆及重组表达质 粒 pCANTAB 5E-scFv-LDP 的构建引物 P5 :5，CAGCATATGAACGCGTACGCTCAGGTGAAG 3，(SEQ ID NO 13)NdeI MluI引物 P6 :5，CGCGAATTCTGAACCGCCTCCACCTTTGATCTCCACCTTGGT 3，(SEQ ID NO 14)EcoRI引物 P7 :5，CGGAATTCGCGCCCGCCTTCTCCGTCAGTCCC3，(SEQ ID NO 15)EcoRI引物 P8 :5，CCGCTCGAGTCAGCCGAAGGTCAGAGCCACGTG 3，(SEQ ID NO: 16)XhoI
以前述获得的质粒pCANTAB 5E-scFv为模板，P5为5’端引物，P6为3’端引物，进 行PCR扩增反应，反应条件94°C预变性5分钟后，94°C变性1分钟，55°C退火1分钟，72 °C 延伸1分钟，30个循环，最后一个循环结束后，72°C延伸10分钟，得到长约760bp的scFv基 因片段。将该反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，并用BioDev公司的玻璃奶试剂盒回收纯 化scFv片段。然后将回收得到的scFv片段按Takara公司18T载体试剂盒提供的方法与18T载 体相连，转化大肠杆菌DH5 α，经转化筛选后得到质粒IST-scFv，阳性克隆测序正确后命名 为18T-ScFv，扩增后进行Ndel/EcoRI双酶切，释放scFv基因片段。质粒pET30sngrldp(保藏号 CGMCCNo. 2010)为模板，P7 为 5，端引物，P8 为 3， 端引物，进行PCR扩增，反应条件94°C变性2min后，94°C变性lmin，58°C退火Imin, 72°C 延伸lmin，25个循环，最后一个循环结束后在72°C延伸lOmin，得到长约330bp的LDP基 因扩增产物。将LDP基因扩增产物进行EcoRI/XhoI双酶切，得到LDP基因片段。将scFv 基因片段与LDP基因片段同时与pGEMTCTakara公司)进行连接，经转化筛选后得到质粒 pGEMT-scFv-LDP。扩增后进行Mlul/Xhol双酶切，释放约IlOObp的scFv-LDP基因片段与进行同样 双酶切的pCANTAB 5E-scFv载体连接、转化大肠杆菌HB2151，筛选阳性克隆，提取质粒，得 重组表达质粒pCANTAB 5E-scFV-LDP并进行酶切鉴定和序列测定。结果表明，融合基因重 组表达质粒pCANTAB5E-scFV-LDP的酶切结果和测序结果与预期完全一致，融合蛋白的基 因编码序列为1176bp，由392个氨基酸组成，序列正确(图lb)。其中scFv-LDP的蛋白质序列如SEQ ID NO :2所示，其中，1_23位为信号肽；24-145 位为轻链可变区；146-160位为(G4S)3 ;161-266位为重链链可变区；267-271位为G4S ； 272-273位为谷氨酸、苯丙氨酸；274-383位为力达霉素辅基蛋白；384-385位为亮氨酸、谷 氨酸；386-391位为6个组氨酸纯化标签。ScFv-LDP的DNA序列如SEQ ID NO 4所示，其中1_69位为信号肽；70-435位为 轻链可变区基因序列；436-480位为(G4S)3 ；481-798位为重链链可变区基因序列；799-813 位为G4S;814-819位为EcoRI酶切位点；820-1149位为力达霉素辅基蛋白基因序列； 1150-1155位为XhoI酶切位点；1156-1173位为6个组氨酸纯化标签；1174-1176位为终止
密码子。所得到的scFv-LDP基因的5，端引入了 MluI酶切位点，3，端引入了 XhoI酶 切位点，利于与pCANTAB 5E载体连接，恰好可利用上步构建的6个连续组氨酸标签肽 (His6-Tag)的密码子，使得表达蛋白的3’端融合有His6-Tag,便于纯化和鉴定。4. IFab-LDP 的表达将前述1中获得的含有质粒pCANTAB 5E-anti-CD20Fab_LDP的大肠杆菌HB2151 的单菌落接种于5ml含氨苄青霉素(Amp)100yg/ml的2XYT培养基中，在恒温摇瓶箱中 37°C，200rpm，振荡培养过夜；移入500ml含Amp 100 μ g/ml的2XYT培养基(1L的2XYT 培养基含1.6%胰化蛋白胨、1.0%酵母抽提物、0.5%氯化钠，PH 7.4)中，37°C，200rpm，振 荡培养8h后，在低温高速真空离心机上6000rpm、4°C离心10分钟收集菌体，将菌体重新悬 浮于 1000ml 含 Amp 100 μ g/ml 及 ImM IPTG 的 2 X YT 培养基，30°C，200rpm，振荡培养 4h ； 8，000rpm、4°C离心10分钟收集菌体，冷冻于_20°C冰箱备用。
将冻存的菌体化冻，加入50ml细菌周质腔蛋白提取液(三羟甲基氨基甲烷 25mmol/L,乙二胺四乙酸 lmmol/L，苯甲基磺酰氟(PMSF) 0. lmmol/L，蔗糖 20% (w/w，NaCl 200mmol/L, pH 7. 5)，振荡混勻，置于4°C轻摇lh。12000rpm，4°C离心20分钟，取上清。将 提取物用PBS透析12h后，在快速蛋白层析仪(FPLC)上进行纯化，用结合缓冲液(0. Olmol/ LNaH2PO4,0.01mol/L Na2HPO4,0. 005% NaN3, pH 7.0)平衡亲和层析柱，上样，再用结合缓冲 液冲洗基线，至基线稳定后，用洗脱缓冲液(0. lmmol/L Glycine,pH 3.0)洗脱，洗脱液用中 和缓冲液(lmol/L Tris-HCl,0. 05% NaN3, pH 8.2)中禾口 pH 值。然后用 12% SDS-PAGE 分 析外源蛋白表达情况，结果表明，经诱导的重组菌株表达了大量外源蛋白，且Fab-LDP的表 达产物主要存在于细菌可溶性周质腔中(图2a)。4. 2 用 Western 印迹法确认 Fab-LDP将4. 1获得到的蛋白进行电泳，电泳后的凝胶在Bio-Rad电转槽中进行半干 电转，条件为恒电流0.7mA/Gm2，时间为5小时。电转结束后的聚偏二氟乙烯膜(PVDF) 与用封闭液10倍稀释的一抗即抗LDP单抗(保藏编号CGMCC No. 1849)孵育，以辣根 过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗，进行显色分析，结果表明，重组 菌株表达的确为C-末端带有LDP的重组融合蛋白Fab-LDP(图2b)。将该含有质粒 pCANTAB5E-anti-CD20Fab-LDP 的表达融合蛋白 Fab-LDP 的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)命名为IHPAYZ，于2009年06月17日送交中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏， 保藏编号CGMCC No. 3125。5. IscFv-LDP (即 anti_CD20 (scFv)-LDP)的表达以3中获得到重组质粒pCANTAB 5E_anti_CD20 (scFv)-LDP转化大肠杆菌HB2151， 得到重组转化菌。挑取单克隆接种于50mL 2XYT培养基中(含100yg/mL氨苄青霉 素)，37°C，200rpm振荡培养过夜；离心收集菌体，将菌体重悬于IOOmL 2XYT培养基(含 100 μ g/mL氨苄青霉素及ImMIPTG) ,30振荡培养4h ；离心收集菌体，将菌体于-20°C冷 冻。分别制备全细胞蛋白组分、培养液上清组分、细胞周质腔组分、可溶性细胞质和不可溶 性细胞质(包涵体)组分，然后在变性条件下进行15%聚丙烯酰胺凝胶电泳分析外源蛋白 表达情况。结果表明，经诱导的重组菌株表达了大量外源蛋白，表达量占全菌总蛋白的30 % 以上，达到30mg/L。且表达产物主要存在于细菌不可溶的包涵体中(图2c)。5. 2 用 Western 印迹法确认 scFv-LDP将4. 3中的蛋白进行电泳，电泳后的凝胶在Bio-Rad电转槽中进行半干电转，条 件为恒电流0. 65mA/cm2,时间为1小时50分钟。电转结束后的聚偏二氟乙烯膜(PVDF) 与用封闭液2000倍稀释的一抗即抗His6-Tag单抗(天根生化科技有限公司目录号 AB102-01)孵育，以辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗小鼠IgG抗体为二抗，进行显色分 析，结果表明，重组菌株表达的确为C-末端带有His6-Tag的重组融合蛋白scFv-LDP(即 Anti-CD20 (scFv) -LDP)(图 2d)。将该含有 pCANTAB5E_anti_CD20 (scFv) -LDP 质粒的表达 scFv-LDP的大肠埃希氏菌(Escherichia coli)命名为IMBPAYZ，于2009年06月17日送 交中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，保藏编号CGMCC No. 3100。5. 3scFv-LDP的纯化和复性采用Novagen公司的His 'Bind纯化试剂盒于变性条件下纯化融合蛋白scFv_LDP 样品，按试剂盒说明书进行操作。对包涵体蛋白样品和亲和层析柱进行预处理后，样品上柱，依次以10倍柱床体积的含6M尿素的结合缓冲液(5mM咪唑，0. 5M NaCl, 20mM Tris-HCl pH 7. 9)，6倍柱体积的含6M尿素的洗涤缓冲液(60mM咪唑，0. 5M NaCl, 2OmMTris-HCl pH 7.9)洗涤层析柱，最后以含6M尿素的洗脱缓冲液(100mMEDTA，0. 5M NaCl, 20mM Tris-HCl PH 7. 9)进行洗脱，收集洗脱组分获得纯化的融合蛋白scFv-LDP(图2e)。将上述纯化后的样品用含6M尿素的洗脱缓冲液稀释至15 μ M，加入2-巯基乙醇至 终浓度为10mM，室温放置30分钟，然后将样品装入透析袋，用至少50倍样品体积的复性液 I(50mM Tris-HCl pH 8. O, ImMEDTA, 200mM NaCl，6M 尿素)透析过夜。再用与复性液 I 同样 组分但尿素浓度依次为3M、2M、1M、0. 5M、0M的50倍体积的缓冲液进行分步透析，在尿素浓 度为IM的阶段加入750 μ M的氧化型谷胱甘肽(GSSG)和400mM的L-精氨酸。将最后一次 透析所得样品用50倍体积磷酸盐缓冲液(PBS，pH 7. 4)透析，每12小时更换一次透析液， 共两次。以上透析操作均于4°C进行。将透析后的样品以10000g，4°C离心30分钟，收集上 清。将上清样品进行浓缩后得到活性融合蛋白scFv-LDP，置于-80°C备用。6. IFab-LDP的免疫学活性通过流式细胞仪测定Fab-LDP的免疫荧光结合活性。将1 X IO6个Raji细胞重悬 于含有不同浓度的 FITC 标记的抗 CD20Fab 片段(Inhibition of human B-cell lymphoma by an anti_CD20antibody andits chimeric(Fab' ) 2 fragment via induction of apoptosis. YinxingLiu, ZhenpingZhu et. al. Cancer Letters 205(2004) 143-153)或 Fab-LDP的IOOyL PBS溶液中，4°C放置lh，2000g，离心10分钟，弃上清液，PBS洗3次， FACS测定抗⑶20Fab片段或Fab-LDP结合Raji细胞的阳性率。证明相同浓度的抗⑶20Fab 片断及Fab-LDP与Raji细胞的结合活性基本相同，Fab-LDP融合蛋白保留了与靶抗原特异 性结合的能力(图3a)。6. 2融合蛋白scFv-LDP的免疫学活性。以酶联免疫吸附分析方法(ELISA)测定scFv-LDP的免疫学活性。首先进行下述 的Raji和Daudi细胞固定在96孔培养板中加入0. 01 %的多聚赖氨酸，200 μ 1/孔，4°C湿 盒中包被过夜。弃去包被液，PBS洗1次。将对数生长期的Raji或daudi细胞，以生理盐 水调整细胞数为2X IO6个/ml，并以50 μ 1/孔加至培养板。800g离心5分钟后，弃去上清 液，并在培养板中加入4°C预冷的0. 05%的戊二醛，50 μ 1/孔，于4°C固定细胞15分钟。固 定好细胞的96孔板用PBS洗3次后，用含的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液200 μ 1/ 孔、4°C封闭过夜。PBS洗3次，加入倍比稀释的待测样品，50 μ 1/孔，每个浓度设三个平行 孔，37°C温育2h。PBST洗板3次，然后加入1 1500倍稀释的anti-His tag单克隆抗体， 50 μ 1/孔，37°C反应lh。PBST洗板3次，然后加入1 2000倍稀释的辣根过氧化物酶标 记的羊抗小鼠IgG，50y 1/孔，37°C反应lh。PBST洗板6次，然后加入OPD邻苯二胺底物反 应液100 μ 1/孔，室温暗处反应10分钟。以2MH2S04 1 00 μ 1/孔终止反应，在酶标仪上测定 490nm吸光值。结果表明，scFv-LDP对Raj i、Daudi淋巴瘤细胞的免疫反应呈阳性，抗体的 相对亲和力约为4Χ1(Γ7Μ、8Χ1(Γ7Μ，但明显低于Fab 8 X ICT8M的亲和力(Inhibition of human B-cell lymphoma by an anti_CD20antibody and its chimeric (Fab' ) 2 fragment via induction ofapoptosis.YinxingLiu, ZhenpingZhu et.al.Cancer Letters205(2004) 143-153)，证明 scFv_LDP(即 anti-CD20scFv_LDP)保留了单抗对 CD20
15抗原部分结合活性(图3b、C)。7.力达霉素的制备及其活性型发色团AE的相对含量测定7. 1力达霉素的制备 将力达霉素产生菌(CGMCC NO. 0135)冷干管中加0. 7ml无盐水，使之形成菌悬液， 用白金耳接种于高氏1号斜面培养基培养，280C，7-10天，表面生长白色气生菌丝，取一小 块接种于一级种子100ml/500ml三角瓶培养(发酵培养基成分为淀粉1 %，玉米浆0. 5%， 血胨 0. 5%，葡萄糖 0. 5%, MgSO4 0. 02%, KI 0. 06%，玉米面 1. 5%, CaCO3 0. 4%,自来水 配制，pH 7. 0，15磅消毒)，28°C，旋转摇床培养48h，在转种5%于1000ml/5000ml立瓶中 作为二级种子，以相同发酵培养基培养，28 V，往返摇床培养18h，上200L发酵罐，装量为 100L,接种量2%，加0. 03%泡敌为消沫剂，罐压0. 04，28°C，搅拌400转/分，气流1/1， PH 6. 5-7.0，发酵96h，得到所需发酵液。取发酵液10L，离心取上清，以HCl调至pH 4.0， 力口 (NH4)2S044. 5Kg于8 °C搅拌3h，析出的力达霉素离心分离(4°C，8000转/分，15min)， 所得的沉淀物加200ml冷水溶解，透析，再离心除去不溶物，上清液经羟基磷灰石柱吸附， 0. OOlM磷酸缓冲液(pH6.8)洗脱，活性部分冷冻干燥，得粗制品1500mg。粗制品溶于水，经 Sephadex G-75柱层析，活性部分冷冻干燥后，得到145mg抗肿瘤高活性的力达霉素白色粉 末精制品。7. 2活性型发色团AE的相对含量测定与LDM蛋白部分相比，发色团分子量较小，其理论含量仅占力达霉素的7. 4%。由 于AE是LDM发挥作用的活性部分，辅基蛋白仅有保护AE的功能，因此一般通过测定AE在 发色团总量中的相对含量，即可以确定LDM制品的活性高低。采用HPLC对LDM进行分析可以测得AE占发色团总量的百分比值，具体方法为将如上述制备的LDM制品溶于HPLC流动相(乙腈水为23 77)，在FPLC快速 蛋白色谱仪上经Waters径向加压C4半制备柱分离，洗脱液为乙腈水(23 77)，自动收 集器收集，用HPLC C4分析柱检测收集到的各组分。分析结果显示，本发明人制备的LDM，其AE组分占LDM发色团总量的90. 63%。通 过分析确定该LDM制品符合LDM的质量控制标准，为AE高含量的LDM精制品，将该LDM制 品冻干，置于-80°C冰箱保存，以便用于强化融合蛋白Fab-LDM、scFv-LDM的制备。7. 3.强化融合蛋白Fab-LDM、scFv-LDM的制备。取高活性LDM冻干品10mg，加5ml冷甲醇振摇5分钟，-20 V放置1小时，中间振 摇1次；在0°C，12000转/分钟离心20分钟，上清液含发色团AE，沉降物为肽链，重复提 取2次。将含有发色团AE的甲醇液蒸发浓缩，-70°C储存。发色团AE不稳定，实验需低温 (4°C)、避光进行。然后取Fab-LDP及scFv-LDP融合蛋白分别溶于PBS中，加入5倍摩尔分子量的 发色团-甲醇溶液(体积比为50 1)，混合振摇，室温放置12小时。最后将混合液进行 PD-10柱层析，经A280nm和A343nm紫外监测后收集强化融合蛋白Fab-LDM及scFv-LDM。8.1 Fab-LDM对体外培养的肿瘤细胞的特异性的细胞毒作用以噻唑蓝(MTT)法进行测定细胞毒作用。取对数生长期的Raji或Daudi细胞、计 数，2X IO4个/孔铺于96孔板，在37°C含5% CO2的培养箱中培养12小时后加入不同浓度 的药物，每个药物浓度设3个平行孔。继续培养48小时，2000rpm/分钟离心10分钟，弃上清。每孔加入20 μ 1 PBS溶解的MTT (5mg/ml)，37°C继续培养4小时，2000rpm/分钟离心10 分钟，轻轻弃去上清，加入100 μ 1 二甲基亚砜(DMSO)，室温下摇床振摇5分钟，酶标仪上测 定546nm光吸收值。每次试验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3孔。按下述公式计算细 胞的存活率及半数抑制浓度(IC5tl)值细胞存活率=(A加药组-A空白组)/(A对照组-A 空白组)X100%。 结果发现强化融合蛋白Fab-LDM对Raji、Daudi细胞的IC5tl值分别为0. 9X IiT10M 和0. 8X ΙΟ,Μ，对无特异性⑶20抗原的Κ562细胞的IC5tl值为3. OX ΙΟ,Μ，而力达霉素对 Raji,Daudi细胞的IC50值分别为3. 1 X 1(Γ10Μ和2. 9X 1(Γ10Μ，对无特异性CD20抗原的Κ562 细胞的IC5tl值为2. 8 X KTiqM,表明Anti-CD20 (Fab)-LDM较好的保留了力达霉素的细胞毒作 用，并对肿瘤细胞有选择性杀伤作用(图4a)。8. 2scFv-LDM对体外培养的肿瘤细胞的特异性的细胞杀伤作用以噻唑蓝(MTT)法进行测定细胞杀伤作用。取对数生长期的Raji或Daudi细胞、 计数，IO4个/孔铺于96孔板，在37°C含5% CO2的培养箱中培养24小时后加入不同浓度 的药物，每个药物浓度设3个平行孔。继续培养72小时，2000rpm/分钟离心10分钟，弃上 清。每孔加入50 μ 1无血清RPMI 1640培养液溶解的MTT (2mg/ml)，37°C继续培养4小时， 2000rpm/分钟离心10分钟，轻轻吸去上清，加入150 μ 1 二甲基亚砜(DMSO)，室温下摇床振 摇15分钟，酶标仪上测定560nm光吸收值。每次试验均设无药对照孔和无细胞对照孔各3 孔。按下述公式计算细胞的存活率及半数抑制浓度(IC5tl)值细胞存活率=(A加药组-A空白组)/(A对照组-A空白组)X 100%。结果发现强化融合蛋白scFv-LDM对Raji细胞、Daudi细胞的IC5tl值分别为 1. 21X 10-"Μ、6· 24X KT11M,对无特异性 CD20 抗原的 MCF7 细胞的 IC50 值为 3. 39 X IO"9 (图 5b)，均有强烈的杀伤作用，本试验结果表明Anti-CD20 (scFv) -LDM较好的保留了力达霉素 的细胞毒作用，并对肿瘤细胞有选择性杀伤作用。9. IFab-LDM对早期裸鼠移植性⑶20+B细胞淋巴瘤模型的治疗作用将生长状态良好的体重为16-18克的5周龄BALB/c裸鼠随机分组，经Cs照射后， 24h内接种于裸鼠腋窝皮下Raji细胞2X IO7个/只，饲养7天，尾静脉注射给药，9天后再 次注射给药，观察Fab-LDM对裸鼠皮下淋巴瘤的治疗作用，绘制小鼠肿瘤的生长曲线。对 照组静脉注射生理盐水0. 2ml/只。其余各组分别给予不同剂量的强化融合蛋白Fab-LDM、 LDM及4pmol/kg的抗⑶20Fab，均为尾静脉注射，0. 2ml/只。试验期间，每三天测量一次肿 瘤的长径a和短径b，并记录动物体重。以公式V = O. 5ab2计算瘤体积，并计算抑瘤率(图 5a)。强化融合蛋白Fab-LDM的治疗结果表明，2pm0l/kg、4pm0l/kg 二个剂量组的Fab-LDM 均能显著抑制或延迟裸鼠移植性淋巴瘤的生长，均表现出比相应剂量游离力达霉素更强的 肿瘤生长抑制作用，提高了力达霉素的治疗效果。在实验第39天的结果显示，4pmol/kg和 2pmol/kg两个剂量组的Fab-LDM的抑瘤率分别为88%和73%，强于相应剂量LDM组49% 和69%的抑瘤率。在实验治疗期间，动物体重有所增加，一般状况良好，表明动物可耐受所 给剂量。表1. Fab-LDM对早期裸鼠移植性⑶20+B细胞淋巴瘤的生长抑制作用
权利要求
融合蛋白，其选自下述序列之一(a)由SEQ ID NO1或3所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列；(b)具有SEQ ID NO1或3所示的氨基酸序列的生物学功能、且与SEQ ID NO1或者3所示的氨基酸序列具有95％以上同源性的氨基酸序列构成的氨基酸序列；和(c)具有SEQ ID NO1或3所示的氨基酸序列的生物学功能，且经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸的SEQ ID NO1或3所示的氨基酸序列构成的氨基酸序列。
2.权利要求1的融合蛋白，其还功能性地结合有式(I)所示结构的发色团AE力达霉素发色团结构式⑴。
3.核酸分子，其编码权利要求1的融合蛋白的基因，其选自下述序列之一(a)SEQ ID NO 2所示的编码SEQ ID NO 1的核苷酸序列；(b)SEQID NO 4所示的编码SEQ ID NO 3的核苷酸序列；(c)编码权利要求1中(b)的氨基酸序列的核苷酸序列；(d)编码权利要求1中(c)的氨基酸序列的核苷酸序列；和(e)因为密码子简并性而分别与SEQID NO :2和4不同、但是编码与SEQ ID NO :2或 4所示序列相同的氨基酸序列的核苷酸序列。
4.载体，其可操作地连接有权利要求3所述的核酸分子。
5.权利要求4的载体，所述载体是质粒。
6.宿主菌，其包含权利要求4所述的载体。
7.权利要求6的宿主菌，其是保藏号为CGMCCNo. 3125，于2009年06月17日送交中 国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的名为IHPAYZ的大肠埃希氏菌。
8.权利要求6的宿主菌，其是保藏号为CGMCCNo. 3100，于2009年06月17日送交中 国普通微生物菌种保藏管理中心保藏的名为IMBPAYZ的大肠埃希氏菌。
9.制备权利要求2的融合蛋白的方法，包括以下步骤(a)将抗CD20抗体的Fab基因与力达霉素辅基蛋白LDP基因可操作地连接到质粒 pCANTAB 5E中，得到重组表达质粒pCANTAB5E_Fab_LDP，或者将抗CD20抗体的可变区单链 scFv基因与力达霉素辅基蛋白LDP基因可操作地连接到质粒pCANTAB 5E中，得到重组表达 质粒 pCANTAB 5E-scFv-LDP,(b)在大肠杆菌HB2151中的诱导表达融合蛋白Fab-LDP、scFv-LDP，(C)纯化及其复性步骤(b)中获得的融合蛋白，(d)使步骤(c)中获得的融合蛋白与式(I)的发色团组装，(e)任选地，其还包括测定步骤(d)中组装后的融合蛋白的生物学活性的步骤。
10.药物组合物，其中含有药学有效量的权利要求1或者2所述的融合蛋白，任选地，还 含有药学上允许的佐剂。
11.权利要求1或者2的融合蛋白在制备用于肿瘤靶向治疗的药物中的用途。
12.权利要求11的用途，所述药物用于靶向杀伤淋巴瘤细胞。
13.权利要求11的用途，其中的淋巴瘤是裸鼠淋巴瘤或者人B细胞淋巴瘤。
全文摘要
本发明涉及抗癌药物力达霉素的强化融合蛋白Anti-CD20(scFv)-LDM及Anti-CD20(Fab)-LDM、其编码基因；还涉及所述强化融合蛋白的基因工程构建方法和所述强化融合蛋白的用途。申请人通过提供上述强化融合蛋白，提供了具有良好靶向性的抗肿瘤药物。
文档编号A61P35/00GK101967192SQ200910157388
公开日2011年2月9日 申请日期2009年7月28日 优先权日2009年7月28日
发明者张胜华, 房虹, 朱祯平, 杨纯正, 熊冬生, 甄永苏, 程昕, 苗庆芳, 许元富, 邵荣光, 金莲舫, 高瀛岱 申请人:中国医学科学院医药生物技术研究所;中国医学科学院血液学研究所