便的加入新的检测指标；
3)系统在多重PCR扩增过程同时进行了单链扩增获得大量单链DNA，提高了系统的灵敏度和准确性；
4)试剂盒采用了可视化膜芯片的检测方式，提高了系统的检测通量，并且检测结果可以直接用肉眼判断，方便，快捷；
5)试剂盒操作简单，经济，无需特殊的昂贵仪器，适用于水产品病毒的检测和大规模筛查。
[0015]因此，本发明克服了现有水产品病毒检测技术费时费力成本高的缺陷，提供的水产品常见病毒检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。
【附图说明】
[0016]图1为本发明用于检测水产品扇贝的杂交结果图，其中图1A为芯片结果模式图，图1B为水产品扇贝的检测结果图。
[0017]图2为本发明用于检测水产品对虾的杂交结果图，其中图2A为芯片结果模式图，图2B为水产品对虾的检测结果图。
[0018]图3为本发明用于检测水产品鲢鱼的杂交结果图，其中图3A为芯片结果模式图，图3B为水产品鲢鱼的检测结果图。
[0019]图4为本发明用于检测水产品鲫鱼的杂交结果图，其中图4A为芯片结果模式图，图4B为水产品鲫鱼的检测结果图。
[0020]附图中，外参基因为人RPS30基因；Positive为阳性对照；Negative为阴性对照。具体实施例
[0021]下面结合附图及实施例进一步详述本发明，但本发明不仅限于所述实施例。
[0022]实施例一
本例的水产品常见病毒检测试剂盒，由引物组合和膜芯片组成，引物组合为7重PCR引物组合，各对引物的碱基序列5’ -3’如下:
甲肝病毒:正向引物:ACAACTGTAAATGGAACCCC 反向引物:AGCAACATGGATGCCCAA ；
星状病毒:正向引物:GAATTTCCTCTCCGCCTGAC 反向引物:CGGTTGTTCTCATCAGAGTCC ；
诺瓦克病毒:正向引物:ACCTAACCACCAGAACCCCTT 反向引物:CTCAGCATCCATTGTTCCAAAGCG ；
轮状病毒:正向引物:CTTTTCCATCCGAAATTAACAC 反向引物:AATATAAGGCAACCACGGTA ；
脊灰病毒:正向引物:AGGAGAAAATTATCCCACAAGC 反向引物:AAACATACTGGTTCAATACGGTG ；
柯萨奇病毒:正向引物:AAAACGTGGCAGCTAATGGA 反向引物:GCCACTCACCATAAGCAACA ；
外参基因:正向引物:GATTTGGACCTGCGAGC 反向引物:GGTTGGCCAGGCGCGAAG。
[0023]本例的引物组合中反向引物的5 ’端接上Tag序列，该Tag序列为5 ’ -AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3’，同时PCR体系中还含有一条5’端带生物素标志(b1tin)的Tag引物，其碱基顺序如下所示: Tag 引物:b1tin-5，-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTAT
GGCT-3’。该Tag引物和反向引物上接上的Tag接头的互补序列配对后，通过调节退火温度进行单引物扩增制备出大量单链DNA。，
膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列、1组阳性对照(Positive)探针序列和1组阴性对照(Negative)探针序列，7组探针序列、阳性对照探针序列和阴性对照探针序列的碱基序列5’ -3’如下:
甲肝病毒探针:TCCAGGAAGACCTTCGCCTT;
星状病毒探针:CTGTCCGCTTCATCGTCTTCGT ；
诺瓦克病毒探针:CCCAACTAATGGCCCTGCTCGGT ；
轮状病毒探针:CAAATTTACTTCCACCGTACACA ；
脊灰病毒探针:TTCCTGACTAGGGCATGATTGGT ；
柯萨奇病毒探针:ACGGTCACTGTAACCACATGCTTC ；
外参基因探针:CTGACCTGAAGGCTCT ；
Positive 探针:GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGAG AAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG ；
Negative 探针:GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCCATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC。
[0024]支持膜为硝酸纤维素膜、尼龙膜或其他有三维孔径结构的支持物。
[0025]通过相应的多重PCR引物设计，采用固相亚磷酰胺三酯法合成得到上述7重PCR组合引物和Tag引物。根据多重PCR扩增产物设计检测探针，采用固相亚磷酰胺三酯法合成探针，探针合成时同时合成阳性探针(positive probe)、阴性探针(negative probe)和与阳性探针对应的5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸(positive oligo)单链DNA，该单链的碱基序列为:b1tin-5’ -CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCT
CGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
[0026]将支持膜裁成1.2cmX 1.8cm的膜条，裁好的膜于双蒸水中浸泡15min，再用15XSSC浸泡15min，取出，置于滤纸上，60°C烘1.5 hour，膜条降温到室温后，将探针(5uM)顺序点在膜上，每个探针重复点样两次，以验证检测结果的可重复性，点样样式见附图，膜条晾干后80°C烘2小时以固定探针，处理好的膜芯片室温保存。
[0027]按照北京康为世纪生物科技有限公司病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒(VirusGenPurificat1n Kit，CW0548)的说明提取水产品扇贝内病毒基因组DNA/RNA，取50g样品按照试剂盒说明抽提后用50ul ddH20 (双蒸水)溶解基因组DNA/RNA，并用紫外分光光度计将DNA/RNA溶液稀释至同一质量浓度(50ng/ul)。
[0028]PCR扩增的反应体系如下所示: ddH20:加至总体积50ul
10XPCR Buffer:5ul
dNTP (2.5mM each):5ul
PCR 引物(20 μ M):0.5ul each
Tag primer (20 μ M):3.5ul
EX-Taq Polymerase (Takara, 5U/ul):0.5ul 提取的产品扇贝中病毒基因组DNA/RNA (约50ng/ul): 2ul
对上述反应体系进行PCR循环扩增，PCR循环条件如下所示，反应过程由预变性、多重PCR循环1和单链PCR循环2组成，条件分别为:
预变性:温度95°C，时间10分钟。
[0029]多重PCR循环1:30个循环组成:
变性:温度95°C，时间45秒。
[0030]退火:温度55 °C，时间30秒。
[0031 ] 延伸:温度72 °C，时间30秒。
[0032]单链PCR循环2:25个循环组成:
变性:温度95°C，时间45秒。
[0033]退火:温度65 °C，时间30秒。
[0034]延伸:温度72 °C，时间30秒。
[0035]最后延伸:温度72°C，时间10分钟。
[0036]然后进行膜芯片斑点杂交检测，膜条于42°C预杂交液(5XSSC，0.1% SDS,lOXDenhardt’ s)中预杂交1小时，之后将膜条放于2ml杂交液(5XSSC，0.1% SDS,5XDenhardt’ s，50%去离子甲酰胺，100ug/ml酵母tRNA)中42°C，1小时。取40ul多重PCR产物加入lul阳性寡核苷酸单链DNA (10uM)，100°C水浴变性5分钟后置于冰上，之后加入 2ml 杂交液中，42°C杂交 16 小时。洗液 1 (2XSSC，0.1% SDS)、洗液 2 (0.5XSSC，0.1%SDS)42°C各洗膜条两次，每次10分钟。将膜条置于封闭液(3%BSA，100 mM Tris_HCl，PH7.5，150 mM NaCl)中37°C封闭30分钟，之后将膜条放到酶联液(用封闭液1:5000稀释链酶亲和素标记辣根过氧化物酶)中37°C，30分钟。用洗液3 (100 mM Tris-HCl，ΡΗ7.5，150 mMNaCl)、洗液 4 (100 mM Tris-HCl，PH9.5，100 mM NaCl, 100 mM MgCl2)各漂洗膜条 3 次，每次5分钟，之后将膜条放入TMB显色液(lOOmM柠檬酸钠PH5.4，0.lmg/ml四甲基联苯胺TMB，1:1600体积比的H202(3%))中，避光显色10~15分钟，依照杂交点的显色情况判定结果。
[0037]本例中所用辅料和配液为外购或自配，百分比为重量百分比。
[0038]本例中水产品扇贝经检测含星状病毒、轮状病毒，检测结果如图1B所示。
[0039]实施例二
本例的水产品常见病毒检测试剂盒，由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)、EX-Taq聚合酶(Polymerase)、5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，该单链的碱基序列如下:b1tin-5’ -CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。
[0040]本例中水产品对虾经检测含诺瓦克