病毒、脊灰病毒，检测结果如图2B所示。
[0041]其余同实施例一。
[0042]实施例三
本例的水产品常见病毒检测试剂盒，由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10 X PCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺(TMB)显色液，其中，预杂交液为5XSSC，0.1% SDS和lOXDenhardt’ s ;杂交液为 5XSSC，0.1% SDS，5XDenhardt’ s，50% 去离子甲酰胺和 100ug/ml 酵母 tRNA ;洗液分别为洗液 1:2XSSC 和 0.1% SDS，洗液 2:0.5XSSC 和 0.1% 505，洗液3:100 mM Tris-HCl,ΡΗ7.5，150 mM NaCl，洗液 4:100 mM Tris-HCl,PH9.5,100 mM NaCl 和 100 mM MgCl2;封闭液为3% BSA, 100 mM Tris_HCl，PH7.5，150 mM NaCl ;四甲基联苯胺显色液分别为四甲基联苯胺显色液A液:200mM柠檬酸钠PH5.4,0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液:3% H202用800体积的双蒸水稀释液，使用前A液B液等量混合配成四甲基联苯胺显色液。
[0043]本例水产品鲢鱼经检测含甲肝病毒、诺瓦克病毒及柯萨奇病毒，检测结果如图3B所示。
[0044]其余同实施例二。
[0045]实施例四
本例的水产品常见病毒检测试剂盒，由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，其中，多重PCR扩增试剂一管600ul，每48ul试剂可检测一个DNA样本，每48ul扩增体系构成如下:10 XPCR Buffer (Takara) 5ul，dNTP (2.5mM each) 5ul，7 对多重 PCR 引物(20 μ M) 0.5uleach，Tag primer(20 μ M) 3.5ul，EX-Taq Polymerase (Takara,5U/ul) 0.5ul，ddH20 加至48ul。每一样本检测需要吸取48ul扩增试剂，加入2ul待检测病毒基因组DNA/RNA (约50ng/ul)ο
[0046]阳性寡核苷酸单链DNA (10uM) —管15ul。
[0047]预杂交液(5XSSC，0.1% SDS，lOXDenhardt’s)—瓶 30ml。杂交液(5XSSC，0.1%SDS，5 X Denhardt’ s，50% 去离子甲酰胺，lOOug/ml 酵母 tRNA) —瓶 30ml。
[0048]洗液1 (2XSSC，0.1% SDS) 10 倍浓缩液一瓶 12ml，使用前加 108ml ddH20。洗液2 (0.5XSSC, 0.1% SDS) 10 倍浓缩液一瓶 12ml，使用前加 108ml ddH20。洗液 3 (100 mMTris-HCl，ΡΗ7.5，150 mM NaCl)10 倍浓缩液一瓶 18ml，使用前加 162ml ddH20。洗液 4(100mM Tris-HCl，PH9.5，100 mM NaCl, 100 mM MgCl2) 10 倍浓缩液一瓶 18ml，使用前加 162mlddH20o
[0049]封闭液/ 酶联液(3%BSA，100 mM Tris-HCl, PH7.5，150 mMNaCl) —瓶 60ml。链酶亲和素标记辣根过氧化物酶(lmg/ml) —管5ul，使用前用封闭液1:5000稀释成酶联液。
[0050]TMB显色液A液(200mM柠檬酸钠PH5.4,0.2mg/ml四甲基联苯胺TMB)—瓶15m 1。TMB显色液B液(1:800体积比的H202 (3%)) 一瓶15ml。使用前A液B液等量混合配成TMB
显色、液。
[0051]本例水产品鲫鱼经检测不含本试剂盒所检测的6种水产品病毒，检测结果如图4B所示。
[0052]其余同实施例三。
【主权项】
1.一种水产品常见病毒检测试剂盒，主要由引物组合和膜芯片组成，其特征在于引物组合为7重聚合酶链式反应引物组合，各对引物的碱基序列5’ -3’如下: 外参基因:正向引物:GATTTGGACCTGCGAGC 反向引物:GGTTGGCCAGGCGCGAAG ; 甲肝病毒:正向引物:ACAACTGTAAATGGAACCCC 反向引物:AGCAACATGGATGCCCAA ; 星状病毒:正向引物:GAATTTCCTCTCCGCCTGAC 反向引物:CGGTTGTTCTCATCAGAGTCC ; 诺瓦克病毒:正向引物:ACCTAACCACCAGAACCCCTT 反向引物:CTCAGCATCCATTGTTCCAAAGCG ; 轮状病毒:正向引物:CTTTTCCATCCGAAATTAACAC 反向引物:AATATAAGGCAACCACGGTA ; 脊灰病毒:正向引物:AGGAGAAAATTATCCCACAAGC 反向引物:AAACATACTGGTTCAATACGGTG ; 柯萨奇病毒:正向引物:AAAACGTGGCAGCTAATGGA 反向引物:GCCACTCACCATAAGCAACA ; 其中，反向引物的5’端接上Tag序列，该Tag序列为 5’ -AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGGCT-3’ ； 引物组合中还含有一条5’端带生物素标志的Tag引物，其碱基顺序如下所示: Tag 引物:b1tin-5，-AGTCCATGTCCCGAAACGTATACCGCAGTATGG CT-3，； 膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列、1组阳性对照探针序列和1组阴性对照探针序列，7组探针序列、阳性对照探针序列和阴性对照探针序列的碱基序列5’ -3’如下: 外参基因探针:CTGACCTGAAGGCTCT ； 甲肝病毒探针:TCCAGGAAGACCTTCGCCTT ; 星状病毒探针:CTGTCCGCTTCATCGTCTTCGT ； 诺瓦克病毒探针:CCCAACTAATGGCCCTGCTCGGT ； 轮状病毒探针:CAAATTTACTTCCACCGTACACA ； 脊灰病毒探针:TTCCTGACTAGGGCATGATTGGT ； 柯萨奇病毒探针:ACGGTCACTGTAACCACATGCTTC ； Positive 探针:GCATCCAGATCAGAAGCAATAATGAGCAGTGCGA GAAGAACGAGTGTCCAAAGTACCAG ； Negative 探针:GGTTCCTTGAGAAATGTTTTACGGGATTACTTCC ATGTTTGTTGGATGATCCTATTTTC。2.根据权利要求1所述的水产品常见病毒检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒主要由引物组合、膜芯片和辅料组成，辅料为dNTPs、EX-Taq聚合酶及5’端带生物素标志的阳性寡核苷酸单链DNA，该单链的碱基序列为:b1tin-5’-CTGGTACTTTGGACACTCGTTCTTCTCGCACTGCTCATTATTGCTTCTGATCTGGATGC-3’。3.根据权利要求2所述的水产品常见病毒检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒由引物组合、膜芯片、辅料和配液组成，配液为10XPCR缓冲液、预杂交液、杂交液、洗液、封闭液、链酶亲和素标记辣根过氧化物酶和四甲基联苯胺显色液。4.根据权利要求3所述的水产品常见病毒检测试剂盒，其特征在于所述预杂交液为5XSSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠和lOXDenhardt’ s液，其中，SSC为0.75M氯化钠和0.075M柠檬酸钠，Denhardt’ s液为1% Ficoll聚蔗糖，1%聚乙烯吡咯烷酮，1%牛血清白蛋白；杂交液为5XSSC，0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，5XDenhardt’ s，50%重量百分比去离子甲酰胺和100ug/ml酵母tRNA ;洗液分别为洗液1、洗液2、洗液3和洗液4，其中，洗液1:2X SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液2:0.5X SSC和0.1%重量百分比十二烷基磺酸钠，洗液3:100 mM Tris-HCl，pH7.5，150 mM恥(:1，洗液4:100 mMTris-HCl，pH9.5，100 mM NaCl和100 mM MgCl2;封闭液为3%重量百分比牛血清白蛋白，100mM Tris-HCl，pH7.5，150 mM NaCl ;四甲基联苯胺显色液由四甲基联苯胺显色液A液和四甲基联苯胺显色液B液使用前等量混合配成，其中，四甲基联苯胺显色液A液:pH5.4的200mM柠檬酸钠和0.2mg/ml四甲基联苯胺，四甲基联苯胺显色液B液:3%重量百分比的H202用800体积的双蒸水稀释液。5.根据权利要求1所述的水产品常见病毒检测试剂盒，其特征在于所述支持膜为硝酸纤维素膜或尼龙膜。
【专利摘要】本发明涉及水产品检测用品领域内的一种水产品常见病毒检测试剂盒，主要由引物组合和膜芯片组成，引物组合为7重聚合酶链式反应引物组合，其中，反向引物的5’端接上Tag序列，引物组合中还含有一条5’端带生物素标志的Tag引物，膜芯片为顺序固定在支持膜表面的7组探针序列、1组阳性对照探针序列和1组阴性对照探针序列。本发明克服了现有水产品病毒检测技术费时费力成本高的缺陷，提供的水产品常见病毒检测试剂盒操作简单，快速灵敏，检测通量大，检测结果可视化，成本低廉。
【IPC分类】C12Q1/68, C12Q1/70
【公开号】CN105349705
【申请号】CN201510916133
【发明人】刘凡, 云振宇, 孙昭, 张瑶, 刘贞, 彭丽萍, 胡太贵, 邓远洪, 黄广平
【申请人】四川华汉三创生物科技有限公司
【公开日】2016年2月24日
【申请日】2015年12月11日