专利名称：鉴别诊断羊痘野毒感染的试剂盒及制备与检测方法
技术领域：
本发明涉及一种诊断试剂盒，确切讲是一种用于鉴别诊断羊痘野毒感染的ELISA 抗体检测试剂盒，试剂盒中有包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗。
背景技术：
羊痘(Capripox)又名羊“天花”，是由羊痘病毒引起的一种急性、热性、接触性传染病。1879年Hansen首次报道了挪威的山羊痘，我国在20世纪40年代先后发现了绵羊痘和山羊痘的流行。羊痘病毒可引起山羊痘(goatpox)、绵羊痘(sheeppox)和牛的结节性疹块病(lumpy skin disease, LSD。本病的主要特征是发热、无毛和少毛部位皮肤黏膜发生丘疹和疱疹、内脏病变(特别是肺)乃至死亡。羊痘是所有动物痘病毒中致病性最为严重的一种，具有高度的传染性，可导致妊娠母羊流产，羔羊死亡，并有非典型症状和继发、并发感染，被世界动物卫生组织(OIE)列为A类重大传染病，我国将其列为一类动物疾病。羊痘在我国的广泛流行，不仅给我国养羊业及毛皮加工业造成了巨大的经济损失，还严重影响了国际贸易和养羊业的发展。目前，羊痘的诊断方法较多，但这些方法也都存在很多问题。传统的实验室诊断要借助电子显微镜，但羊痘病毒与传染性脓疱性皮炎病毒在形态上相似，很难区分。琼脂扩散实验(AGID)可用于羊痘病毒的抗原检测，但该抗原与副痘病毒有交叉反应。间接荧光抗体实验(IFAT)存在较深的背景颜色和非特异性反应，同时，此法不能区分羊口疮(orf)、牛脓疱性口炎病毒。病毒中和试验(VNT)是检测羊痘病毒特异性较强的血清学诊断方法，也是目前《国际动物卫生法典》要求的替代诊断试验(目前羊痘尚无指定血清学诊断方法)。然而羊痘感染后主要以细胞免疫为主，动物接触病原后仅产生低水平的中和抗体，所以病毒中和试验敏感性不高。Western印迹试验是以羊痘病毒感染的细胞溶解物检查血清样品中病毒结构蛋白的特异性抗体，具有较好的敏感性和特异性，但该试验价格昂贵，操作繁琐。酶联免疫吸附试验(ELISA)因其操作方便、快速、敏感、特异性强等优点，现已被广泛应用于许多抗原抗体的检测。1988年arnrm应用山羊痘痂皮制成粗抗原建立了山羊痘抗体的间接 ELISA 方法，参见 Siarm S N, Negi B S. Yadav M P. et al. Application of ELI SA in the detection of goat pox antigen and antibodies. Acta Virologica, 1988,32 :65-69,但试验的本底值太高，易出现假阳性结果。1997年Rao建立了检测羊痘病
Rao Τ. V. S. Nandi. Evalution of immunocaputure ELISA for diagnosis of goatpox. Acta Virologica，1997，41 :345_348，但该方法单独使用时有一定的限制，需要与对流免疫电泳试验共同应用才能确诊。应用纯化的具有较强抗原性的重组蛋白做抗原进行ELISA可提高其敏感性，1999年Heine利用表达的羊痘病毒P32蛋白为抗原进行ELISA取得成功，参见Heine H G，et al. A capripoxvirus detection PCR and antibody ELISA based on the major antigen P32the homolog of the vaccinia virus H3L gene. Journal oflmmunological Methods，1999，227 :187-196，然而P32 蛋白制备难度很大，限制了该ELISA方法的应用。因此，筛选能稳定而大量表达的免疫原性强的抗原基因是建立可靠ELISA方法的关键。羊痘的预防主要依靠疫苗的免疫接种，灭活疫苗具有安全、无毒的特点，但灭活苗的免疫效果较差，弱毒疫苗则具有良好的免疫效果。羊痘病毒的疫苗株与野毒株之间的差异很小，两者氨基酸序列的同源性高达99.9%，因此，接种弱毒疫苗后很难区分疫苗免疫和野毒自然感染。山羊痘弱毒疫苗可同时用于山羊痘和绵羊痘的预防，接种4 5日后即可产生免疫力，抗体持续期可长达12个月，有的羊甚至产生终身免疫。所以，进行羊痘的抗体检测关键在于能否有效的避开弱毒疫苗带来的干扰，目前尚无任何一种能区分出弱毒免疫与野毒感染的检测方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种能鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体检测试剂盒，该试剂盒能特异性检测出羊痘野毒株的抗体，排除弱毒疫苗免疫后的抗体干扰。本发明同时提供这种检测试剂盒的制备与使用方法。本发明的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体检测试剂盒中有包被抗原的 ELISA抗体检测板和酶标二抗，其包被的抗原为重组羊痘病毒0RF95蛋白和0RF103蛋白的混合物。本发明的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体检测试剂盒中，其所用的 ELISA抗体检测板的规格为8孔X 12条的可拆酶标板，所包被的抗原为重组羊痘病毒 0RF95蛋白和重组0RF103蛋白的混合物。本发明的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体检测试剂盒中，酶标板每个孔中抗原包被量为0RF95蛋白10ng，ORF 103蛋白20ng，所使用的酶标二抗工作液为Sigma 公司兔抗山羊酶标二抗经IXblocking buffer (Sigma)稀释6万倍。本发明提供的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体检测试剂盒中所用的重组羊痘病毒0RF95蛋白和0RF103蛋白的制备方法是以山羊痘病毒弱毒疫苗株基因组DNA 为模板，分别以两对特异引物进行PCR扩增，扩增产物经酶切后与pET30a(+)表达载体连接，分别构建原核表达载体pET-95和pET-103，转化BL21宿主菌，将阳性重组菌接种于卡那抗性LB培养基中进行诱导表达，分别得到0RF95重组蛋白和0RF103重组蛋白，收集大量表达的宿主菌并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用滤膜过滤，经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化得到目的蛋白，所用的两对特异引物分别如下0RF95 上游弓丨物ACCGAATTCATGGACTTCATGAAAAAATATACT ；0RF95 下游引物ACCAAGCTTTTTGCTGTTATTATCATCCAG ；0RF103 上游引物ACCGAATTCATGTCTGATAAAAAATTATCTCG ；0RF103 下游引物ACCAAGCTTATCCATACCATCGTCGATAG。本发明的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体检测试剂盒中酶标板的制备方法是用PH9. 6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将纯化的0RF95和0RF103重组蛋白混勻， 使得0RF95的终浓度为100ng/mL，0RF103的终浓度为200ng/mL，按IOOuL/孔加入酶标板中，0RF95重组蛋白每孔的包被量为10ng，0RF103重组蛋白每孔的被量为20ng，4°C包被过夜，用PBST洗板四次，每孔加入200uL IXblocking buffer 37°C封闭1小时，用PBST洗板四次，室温晾干，装入干燥剂进行真空包装，置4°C保存；酶标二抗工作液为Sigma公司兔抗山羊酶标二抗经IXblocking buffer (Sigma公司)稀释6万倍而成；样品稀释液为 1 Xblocking buffer ；10倍浓缩洗涤液为含0. 5%吐温-20的0. 1M、ρΗ7· 4磷酸盐缓冲液； 底物显色液为四甲基联苯胺(TMB)；终止液为2Μ硫酸溶液。本发明的鉴别诊断羊痘野毒感染的ELISA抗体检测试剂盒的使用方法是(1)将IOX浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；(2)待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清均用抗体稀释液作1 100倍稀释， 按每孔IOOuL加入抗体检测板中，37°C孵育30min，甩干；(3)每孔加入200uL洗涤液，洗涤4次，每次lmin，甩干；(4)每孔加入IOOuL 二抗工作液，37°C孵育30min，甩干；(5)每孔加入200uL洗涤液，洗涤4次，每次lmin，甩干；(6)每孔加入IOOuL TMB显色液，37°C避光孵育5min ；(7)每孔加入50uL终止液，用酶标仪在450nm波长下读取光吸收值(OD45tlnm值)。最后根据测得的OD值确定待检样品是否是野毒感染，当0D450 > 0. 3判定为阳性；0D450 < 0. 25时样品判为阴性；当0. 3 > 0D450 > 0. 25时判为可疑，此时样品需复检一次，若0D450 > 0. 3判定为阳性，否则判为阴性。本发明中所用的ELISA包被抗原0RF95和0RF103是羊痘病毒粒子的核心蛋白，其序列见后附基因序列表中SQ LNa 5和SQL Na 6。0RF95和0RF103在病毒粒子的装配中发挥重要的作用。本发明经试验证明，由0RF95和0RF103蛋白混合包被所建立的间接酶联免疫吸附试验能特异性的进行羊痘野毒感染的抗体检测，有效地排除羊痘弱毒疫苗免疫带来的干扰。本发明优选的方法是通过原核表达并纯化的0RF95和0RF103重组蛋白制备检测试剂盒，这种检测试剂盒操作简单快速、结果稳定可靠且成本低廉，具有很强的实用性和推广性。与现有技术相比，本发明具有如下优点1、本发明所采用的0RF95和0RF103重组蛋白便于大量制备和纯化。与P32蛋白的表达相比，0RF95和0RF103在pET原核表达系统中得到了高效的表达，携带组氨酸标记的重组蛋白易于纯化。2、本发明所使用的重组蛋白纯度高，活性好。抗原的方阵滴定试验显示，每个酶标孔只需包被IOng的0RF95和20ng的0RF103就能取得很好的检测结果。3、本发明的试剂盒特异性强，能有效的排除羊痘弱毒疫苗免疫的干扰，特异性的检测羊痘野毒感染，这是现有的任何方法所无法实现的。4、本发明的试剂盒结果判定灵敏、准确、可靠。采用TMB底物进行显色，酶标仪进行结果判定，阴阳性结果差异明显，比OPD显色更加灵敏稳定。5、利用本发明的试剂盒能在1. 5h内完成检测。该诊断方法操作简单，耗时短，成本低，非常适合大量动物血清样品的检测。
图1为0RF103和0RF95基因的核酸电泳鉴定图，其中各泳道为1、2、3为0RF103 ； 4、5、6 为 0RF95 ；M :DL2000。图20RF103和0RF95重组蛋白的表达和纯化产物的SDS-PAGE电泳鉴定图其中各泳道为1、2 经Ni柱纯化的0RF103重组蛋白；3、4 纯化前的0RF103重组蛋白产物；M Marker ；5 纯化前的0RF95重组蛋白产物；6、7、8泳道为经Ni柱纯化后的0RF95重组蛋白。
具体实施例方式以下为本发明的具体实施例1、山羊痘病毒0RF95和0RF103基因的克隆和原核表达载体的构建参考GenBank中羊痘病毒基因组序列(AY07783》设计0RF95和0RF103基因的特异性引物，引物序列为0RF95 上游引物:ACCGAATTCATGGACTTCATGAAAAAATATACT,划线部分为 EcoRI 酶切位点；下游引物:ACCAAGCTTTTTGCTGTTATTATCATCCAG,划线部分为HindIII 酶切位点；0RF103 上游引物:ACCGAATTCATGTCTGATAAAAAATTATCTCG,划线部分为 EcoRI 酶切位点；下游引物:ACCAAGCTTATCCATACCATCGTCGATAG,划线部分为HindIII 酶切位点；通过PCR扩增大小为483bp的0RF95和570bp的0RF103特异性目的基因，酶切后与pET30a(+)表达载体连接，构建原核表达载体pET-95和pET_103，通过PCR、双酶切和测序鉴定表明，成功构建0RF95和0RF103基因原核表达载体，其电泳图见图1。2、0RF95和0RF103重组蛋白的高效表达和纯化原核表达载体pET-95和pET-103转化BL21 (DE3)，将阳性重组菌接种于卡那抗性 LB培养基中37 °C振荡培养，当菌液0D600达到0. 6时加入IPTG进行诱导表达，IPTG的终浓度为ImM。离心收集大量表达的宿主菌并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用0. 45的滤膜过滤，经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化重组蛋白，SDS-PAGE电泳鉴定表明，0RF95重组蛋白大小约为30kD，0RF103重组蛋白大小约为35kD。其电泳图见图2。3、ELISA抗体检测板的抗原最佳包被剂量和包被方法0RF95和0RF103两种重组蛋白分别采用如下的包被方式进行方阵滴度试验，见表 1。表 权利要求
1.鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体试剂盒，其中有包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗，其特征在于包被的抗原为羊痘病毒0RF95蛋白和ORF 103蛋白的混合物。
2.根据权利要求1所述的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体试剂盒，其特征在于所用的ELISA抗体检测板的规格为8孔X 12条的可拆酶标板，所包被的抗原为重组羊痘病毒0RF95蛋白和重组0RF103蛋白的混合物。
3.根据权利要求1或2所述的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体试剂盒，其特征在于其中每孔的抗原包被量为0RF95蛋白10ng，0RF103蛋白20ng ；酶标二抗工作液为兔抗山羊酶标二抗经IXblocking buffer (Sigma)稀释6万倍。
4.权利要求2或3所述的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体试剂盒中所用的重组羊痘病毒0RF95蛋白和重组羊痘病毒0RF103蛋白的制备方法，其特征是以山羊痘病毒弱毒疫苗株基因组DNA为模板，分别以两对特异引物进行PCR扩增，扩增产物经酶切后与 pET30a(+)表达载体连接，分别构建原核表达载体pET-95和pET_103，经转化BL21宿主菌表达和纯化后，将阳性重组菌接种于卡那抗性LB培养基中进行诱导表达，分别得到0RF95 重组蛋白和0RF103重组蛋白，收集大量表达的重组宿主菌并超声裂解，用8M尿素溶解包涵体并用滤膜过滤，经镍琼脂糖凝胶亲和层析纯化得到目的蛋白，所用的两对特异引物分别如下0RF95 上游引物ACCGAATTCATGGACTTCATGAAAAAATATACT ；0RF95 下游引物ACCAAGCTTTTTGCTGTTATTATCATCCAG ；0RF103 上游引物ACCGAATTCATGTCTGATAAAAAATTATCTCG ；0RF103 下游引物ACCAAGCTTATCCATACCATCGTCGATAG。
5.权利要求3所述的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体试剂盒的制备方法，其特征在于用PH9. 6的碳酸盐缓冲液作为包被液，将纯化的0RF95和0RF103重组蛋白混勻， 使得0RF95的终浓度为100ng/mL，0RF103的终浓度为200ng/mL，按IOOuL/孔加入酶标板中，0RF95重组蛋白每孔的包被量为10ng，0RF103重组蛋白每孔的被量为20ng，4°C包被过夜，用PBST洗板四次，每孔加入200uL IXblocking buffer 37°C封闭1小时，用PBST洗板四次，室温晾干，装入干燥剂进行真空包装，置4°C保存；酶标二抗工作液为兔抗山羊酶标二抗经IXblocking buffer做6万倍稀释而成；样品稀释液为1 Xblocking buffer ；10 倍浓缩洗涤液为含0. 5%吐温-20的0. 1Μ、ρΗ7. 4磷酸盐缓冲液；底物显色液为四甲基联苯胺；终止液为2M硫酸溶液。
6.根据权利要求3所述的鉴别诊断羊痘野毒感染的ELISA检测试剂盒使用方法，其特征是(1)将IOX浓缩洗涤液稀释10倍即为洗涤液；(2)待检血清、阳性对照血清和阴性对照血清均用抗体稀释液作1 100倍稀释，按每孔IOOuL加入抗体检测板中，37°C孵育30min，甩干；(3)每孔加入200uL洗涤液，洗涤4次，每次lmin，甩干；(4)每孔加入IOOuL二抗工作液，37°C孵育30min，甩干；(5)每孔加入200uL洗涤液，洗涤4次，每次lmin，甩干；(6)每孔加入IOOuLTMB显色液，37°C避光孵育5min ；(7)每孔加入50uL终止液，用酶标仪在450nm波长下读取光吸收值(OD45tlnm值)；根据测得的OD值确定待检样品是否是野毒感染。
全文摘要
本发明为公开一种用于鉴别诊断羊痘野毒感染的ELISA抗体检测试剂盒。本发明的鉴别诊断羊痘野毒感染的间接ELISA抗体检测试剂盒中有包被抗原的ELISA抗体检测板和酶标二抗，其包被的抗原为重组羊痘病毒ORF95蛋白和ORF103蛋白的混合物。本发明所采用的ORF95和ORF103重组蛋白便于大量制备和纯化。本发明试剂盒特异性强，能有效的排除羊痘弱毒疫苗免疫的干扰，特异性的检测羊痘野毒感染。
文档编号G01N33/569GK102183643SQ20101062372
公开日2011年9月14日 申请日期2010年12月27日 优先权日2010年12月27日
发明者刘振勇, 才学鹏, 朱学亮, 李辉, 窦永喜, 骆学农 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所