专利名称：基于减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗及制备方法
技术领域：
本发明涉及一种基于减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗及制备方法。
背景技术：
山羊痘是由山羊痘病毒(GPV)引起山羊或绵羊的一种急性、热性、高度接触性传染病，具有较高的发病率和死亡率，为国际兽疫局(OIE)A类动物疫病和我国农业部一类动物疫病。山羊痘不仅可以引起山羊皮肤和粘膜发生丘疹和疱疹，影响采食和消化机能，而且还可导致怀孕母羊流产，是威胁养羊业可持续健康发展的重要疫病之一。目前，对山羊痘防控主要以接种弱毒疫苗预防为主，但山羊痘弱毒疫苗须在尾根皮内注射或股内侧皮下注射，操作技术要求较高，且应激反应大，同时还存在着毒力返强危险性。因此，研究新型安全疫苗成为山羊痘防制的主要方向之一。据研究资料显示，山羊痘病毒P32基因所编码的P32蛋白是目前世界各地所有分离鉴定的山羊痘病毒共有且特异性强的结构蛋白，具有较强的抗原性，能诱导山羊细胞免疫和体液免疫应答反应，产生特异性中和抗体和各种细胞因子，在山羊痘的预防与控制上发挥重要作用。以减毒沙门氏菌为载体的口服疫苗具有以下优点一是高效递呈抗原，即通过减毒沙门氏菌运载DNA疫苗能特异地将质粒靶向传递给相关抗原递呈细胞内；二是持续性免疫刺激，即减毒沙门氏菌侵入宿主后，菌体及其质粒在一段时间内有限增殖，可持续刺激宿主；三是免疫佐剂作用，即沙门氏菌内毒素可作为一种免疫佐剂，增强免疫应答效果；四是接种方便，即以减毒沙门氏菌为载体的口服疫苗可采用滴鼻、点眼或口服等多种途径免疫， 方便快捷；五是制备简便，即接种前只需要将制备好的重组减毒沙门氏菌进行培养即可。关于以P32基因为靶基因的减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗未见报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，提供一种以减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗及制备方法，该疫苗是以减毒沙门氏菌SL7207为载体的稳定型山羊痘口服疫苗，对山羊肠道微生态平衡影响轻微，目的基因不与宿主染色体发生整合，具有良好的安全性；能诱导山羊产生抗GPV P32蛋白的血清IgG与SIgA，促进多种细胞因子如IL_2、IL-4与IFN-γ等的分泌，具有良好的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答效果。本发明的技术方案含山羊痘病毒Ρ32基因真核表达质粒pmcDNA3. 1 (+)_P32的减毒鼠伤寒沙门氏菌，菌体浓度为108~9个/mL。所述的以减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗的制备步骤包括
第一，将真核表达质粒PCDNA3. 1(+)氨苄青霉素抗性bla基因启动子去除，构建改良质粒 pmcDNA3. 1 (+)；
第二，将PCR扩增从pMD-18T-P32/LD中获取山羊痘病毒P32基因，定向插入步骤一制得的改良质粒pmcDNA3. 1 (+)，构建重组质粒pmcDNA3. 1-P32 ；第三，将步骤二制得的重组质粒pmcDNA3. 1-P32转化至鼠伤寒减毒沙门氏菌 SL7207 (aro A_)中，构建山羊痘口服疫苗；
第四，将步骤三制得的山羊痘口服疫苗进行体外培养，分析检测其稳定性、安全性以及免疫效果；
第五，分析检测合格即制得以减毒沙门氏菌为载体的山羊痘口服疫苗。本发明有益效果本发明适用于山羊痘的免疫接种，防制山羊痘的发生与流行，同时具有良好的经济效益和生态效益。本发明与现有技术相比，具有以下的技术优势和积极效果
(1)免疫效果确实本发明利用减毒沙门氏菌具有细胞侵袭的特点，可将含P32基因的真核表达质粒pmcDNA3. 1-P32直接送至细胞内，能诱导免疫山羊产生良好的体液免疫、 细胞免疫和粘膜免疫应答；
(2)安全性能稳定本发明采用的是减毒沙门氏菌，不会引起接种山羊发生临床症状和病理变化；口服接种后也不会引起山羊胃肠道微生态发生明显改变，同时山羊痘P32基因也不与宿主染色体发生整合现象；
(3)传代性状可靠由于本发明将pmcDNA3.1(+)的氨苄青霉素抗性bla基因启动子去除而改良为pmcDNA3. 1，使携带真核表达质粒pmcDNA3. 1-P32的减毒沙门氏菌(口服疫苗) 在体外连续培养18代，未发现携带质粒丢失现象，且其诱导山羊免疫应答效果与第一代一致；
(4)疫苗制备简单由于减毒沙门氏菌的培养需求不严，在普通培养基上能良好地生长，因此需要实施山羊痘免疫接种时，只需将制备好的重组减毒沙门氏菌(口服疫苗)进行培养即可。
图1本发明的山羊痘口服疫苗的制备生产流程图。
具体实施例方式
具体实施例方式
以减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗的原料为山羊痘病毒LD分离株、真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)和减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207 (aro A)。如图1所示意，本发明的疫苗的制备方法为
第一，真核表达质粒pcDNA3. 1(+)的改良采用含R^I和MA/I酶切位点的氨苄青霉素抗性bla基因无启动子特异性引物从真核表达质粒pcDNA3. 1(+)中扩增出无启动子bla基因，琼脂糖回收试剂盒回收纯化，和MA/I双酶切再回收纯化，与同样酶切处理的线性真核表达质粒pcDNA3. 1 (+)进行连接，构建改良真核表达质粒pmcDNA3. 1 (+)；
第二，重组真核表达质粒pmcDNA3. 1-P32的构建采用含Ba HI和Η /ΙΙΙ酶切位点的山羊痘病毒Ρ32基因特异性引物从山羊痘病毒LD分离株中扩增获取GPV Ρ32基因，琼脂糖回收试剂盒回收纯化,PagI和Μ/"Ι双酶切再回收纯化，与同样酶切处理的改良真核表达质粒pmcDNA3. 1 (+)进行连接，构建重组真核表达质粒pmcDNA3. 1-P32 ；
第三，重组减毒沙门氏菌的构建将步骤二制得的重组真核表达质粒pmcDNA3. 1-P32转化至鼠伤寒减毒沙门氏菌SL7207(aro A_)中，构建重组减毒沙门氏菌即山羊痘口服疫苗；
第四，重组减毒沙门氏菌的稳定性检测将构建的重组减毒沙门氏菌分别接种于含Amp+和不含Amp-的LB液体培养中，37 °C培养Mh，再取菌液连续18代，采用PCR方法检测重组减毒沙门氏菌中的改良真核表达质粒pmcDNA3. 1-P32，以重组真核表达质粒 pmcDNA3. 1-P32不丢失判定为合格；
第五，重组减毒沙门氏菌的安全性检测将构建的重组减毒沙门氏菌口服接种小白鼠 20只，IO9个菌体/mL, 2mL/只，于第3d、6d、9d、12d和15d时观察小白鼠的临床表现，并在每个时间段剖杀2只观察内脏组织病变情况，并采用荧光定量PCR方法检测胃肠道主要细菌动态变化，若小白鼠未表现明显的临床症状和病理变化，且不发生死亡，同时小白鼠胃肠道微生态未发生明显变化，即说明所制备的重组减毒沙门氏菌(山羊痘口服疫苗)具有良好的安全性；
第六，重组减毒沙门氏菌的免疫效果检测将构建的重组减毒沙门氏菌口服接种小白鼠40只，IO9个菌体/mL, 2mL/只，于第8d、15d、22d、29d、36d、43d和50d时剖杀小白鼠，每次5只，收集血清样本和组织样本，测定血清特异性IgG水平、消化道粘膜SIgA含量、脾T 淋巴细胞转化率和血清主要细胞因子含量，以上述指标与未接种重组减毒沙门氏菌对照小白鼠呈现明显提高者判定为免疫合格；
通过上述步骤证实基于减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗构建成功。
权利要求
1.一种基于减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗，其特征在于含山羊痘病毒P32基因真核表达质粒pmcDNA3. 1⑴-P32的减毒鼠伤寒沙门氏菌，菌体浓度为108~9个/mL。
2.一种如权利要求1所述的一种基于减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗的制备方法，其特征在于它包括以下步骤第一，将真核表达质粒PCDNA3. 1(+)氨苄青霉素抗性bla基因启动子去除，构建改良质粒 pmcDNA3. 1 (+)；第二，将PCR扩增从pMD-18T-P32/LD中获取山羊痘病毒P32基因，定向插入步骤一制得的改良质粒pmcDNA3. 1 (+)，构建重组质粒pmcDNA3. 1-P32 ；第三，将步骤二制得的重组质粒pmcDNA3. 1-P32转化至鼠伤寒减毒沙门氏菌 SL7207 (aro A_)中，构建山羊痘口服疫苗；第四，将步骤三制得的山羊痘口服疫苗进行体外培养，分析检测其稳定性、安全性以及免疫效果；第五，分析检测合格即制得以减毒沙门氏菌为载体的山羊痘口服疫苗。
全文摘要
本发明公开了一种基于减毒沙门氏菌为载体山羊痘口服疫苗及制备方法，本发明疫苗含山羊痘病毒P32基因真核表达质粒pmcDNA3.1(+)-P32的减毒鼠伤寒沙门氏菌，菌体浓度为108~9个/mL。本发明山羊痘口服疫苗安全有效，可诱导山羊产生机体产生特异性的体液免疫、细胞免疫和粘膜免疫应答，能有效预防山羊痘的发生与流行。
文档编号A61K39/275GK102233131SQ201110189128
公开日2011年11月9日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者周碧君, 尹传宝, 文明, 王开功, 程振涛 申请人:贵州大学