专利名称：人源抗人催乳素受体抗体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于基因工程技术和生物制品领域，具体涉及一种人源抗催乳素受体抗体 (hPRLR-Fab)及其应用。
背景技术：
抗体在疾病的诊断、治疗和预防中发挥着重要的作用，目前在世界范围内，抗体药物已占整个临床使用的生物药品的30%，其中单克隆抗体因具有靶向特异性的优点，作为治疗性抗体表现出广泛的应用前景，已逐步发展为一大类独立医药产品[1]。目前研制的单克隆抗体多为鼠源性，而鼠源性单抗作为异源性蛋白在人体内可诱发抗鼠抗体(Human Anti-Mouse Antibody,HAMA)的产生，使其在临床治疗中的应用受到了极大的限制，所以只有将其人源化，才能有效地应用于临床治疗。近年来，人源化抗体和全人源化抗体的出现，为治疗性抗体在临床上的广泛应用带来了希望，特别是伴随着一系列重大生物技术的发展，制备全人源化抗体在肿瘤治疗中已显示出独特的优势。目前转基因小鼠和抗体库技术是制备全人源抗体两个重要的技术手段[2’3]。其中利用噬菌体抗体库技术，通过链更替将鼠单抗Fab片段转换成完全人源化抗体，这种形式的抗体由于有100%的人抗体序列，因此从根本上克服了 HAMA反应的出现。同时与传统的杂交瘤技术相比，噬菌体抗体库技术集抗体筛选、特异性鉴定和亲和力成熟于一体，可实现绕过动物免疫制备单克隆抗体，具有简便易行、筛选容量大、过程短、利于基因工程改造和生产成本低等优点。因而噬菌体抗体库技术是目前抗体人源化改造和功能性抗体筛选的最理想的方式。乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤，虽然乳腺癌的手术、放疗、化疗和内分泌治疗取得了很大的进展，但对于进展期和转移的乳腺癌却仍无有效的治疗手段。多年来，人们一直在探索应用免疫学的方法来治疗乳腺癌，但直到1998年，美国FDA批准针对乳腺癌基因过表达产物HER2受体的人源化单克隆抗体Herceptin用于乳腺癌的临床治疗，人们才真正看到了生物免疫治疗乳腺癌的曙光。由于乳腺癌的病因学尚不十分清楚，遗传、激素、免疫与各种环境因素相互作用，均可能与乳腺癌变的演进过程有关，但值得重视的是，乳腺是主要性激素与众多细胞因子反应的组织器官，在乳腺细胞中，激素、受体、细胞因子及其相关基因产物组成一个复杂的免疫内分泌调节网络，表明了乳腺癌也是一个激素依赖性肿瘤，激素通过与其特异性受体的结合而行使功能，如雌激素、孕激素和催乳素等M，其中引人关注的是人催乳素(human prolactin, hPRL)，hPRL不仅可以通过内分泌机制影响乳腺细胞生长、发育分化，还可作为乳腺所产生、释放的细胞因子，以旁分泌和自分泌方式调节乳腺细胞的反应，hPRL作用的信号转导机制是通过位于细胞膜上的人催乳素受体(human prolactin receptor,hPRLR)来完成。在乳腺组织中，hPRLR基因的表达水平对细胞增殖起着重要的作用，hPRLR表达水平的上调，将引起错误的级联反应，造成乳腺细胞的异常增生， 进而诱发乳腺癌发生。因此，有效拮抗hPRLR与hPRL的结合或利用高表达的hPRLR信号转导途径为乳腺癌的生物免疫治疗提供了一种新的策略。
随着分子生物学、细胞生物学和免疫学研究的进展，特别是噬菌体抗体库技术的出现使人源化抗体的制备产生了突破性进展，对于乳腺癌的生物免疫治疗具有极其重要的应用价值。本发明通过获得人源抗hPRLR抗体，并由此构建乳腺癌患者的人源IgGFab噬菌体抗体库，既可满足高通量筛选乳腺癌患者高表达的靶蛋白的单克隆抗体的需要，从而为乳腺癌的分子免疫治疗提供新的作用靶点和抗体药物候选靶标分子，还为治疗以hPRLR为靶向分子的抗乳腺癌生物免疫治疗提供了有效途径。参考文献[l]Hudson PJ, Souriau C. Engineering antibodies. Nature Medicine,2003,9 129-134.[2]ffinter G,Griffiths AD,Hawkins RE,Hoogenboom HR. Making antibodies by phage display technology. Annu Rev Immunol. . 1994 ； 12 :433-455.[3] Tomizuka K, Shinohara Τ, Yoshida H, Uej ima H, Ohguma A, Tanaka S, Sato K, Oshimura M, Ishida I.Double trans—chromosomic mice !maintenance of two individual human chromosome fragments containing Ig heavy and kappa loci and expression of fully human antibodies. Proc Natl Acad Sci USA. . 2000,97 :722-727.[4]Martin A M, Weber B L. Genetic and hormonal risk factors in breast cancer[J], J Natl Cancer Inst，2000，92 :1126—1135.
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供以人催乳素受体(hPRLR)为靶向分子的抗乳腺癌全人源化抗体，该抗体能够用于高表达hPRLR的乳腺癌患者的生物免疫治疗。本发明还要解决的技术问题是提供上述人源抗人催乳素受体抗体在制备治疗人乳腺癌肿瘤上的生物免疫制剂中的应用。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种人源抗人催乳素受体抗体，其特征在于，它包括重链Fd段可变区和轻链可变区，其中，所述重链Fd段可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。上述人源抗人催乳素受体抗体的编码基因也属于本发明的保护范围。其中，所述的编码基因如SEQ ID No. 1和SEQ ID No. 3所示。上述人源抗人催乳素受体抗体在制备治疗人乳腺癌药物中的应用。本发明的人源抗人催乳素受体抗体采用如下思路获得首先建立人乳腺癌IgG Fab噬菌体抗体库，然后筛选特异性抗体，并应用噬菌体表面展示表达技术直接获得谜底单克隆抗体，本抗体库可获得其他高亲和力的特异性目的抗体，用此方法制备的抗hPRLR抗体从根本上克服了 HAMA反应。具体的步骤如下(1)淋巴细胞的分离纯化从乳腺癌患者的外周血中分离淋巴细胞，提取总RNA， 通过RT-PCR逆转录合成cDNA ；(2)PCR扩增Fab抗体轻链基因以cDNA为模板，用一组几乎覆盖人免疫球蛋白 G(IgG)全部轻链可变区编码序列的特异性引物分别扩增人免疫球蛋白的轻链基因，得到几乎覆盖人免疫球蛋白G(IgG)的完整κ链和λ链的轻链基因；
(3) PCR扩增Fab抗体重链基因以cDNA为模板，用一组特异性引物分别扩增人免疫球蛋白的Fd重链基因，得到人免疫球蛋白G(IgG)的重链Fd部分Vh和ChI基因片段；(4)Fd段和轻链基因的克隆及噬菌体抗体库的建立建库时采取先克隆轻链基因，后重链基因，将噬菌体载体pCom3XSS和PCR产物的酶切片段在高浓度连接酶作用下连接；经过多轮的抗原亲和吸附、洗脱、扩增，最终筛选出抗原特异的抗体克隆，然后转化宿主使目标抗体表达，构建大容量Fab噬菌体抗体库，并检测库容量和对抗体库进行质量鉴定。(5)利用所构建的人乳腺癌IgG Fab噬菌体抗体库富集筛选全人源抗hPRLR抗体。步骤(1)中，所提取的总RNA来源于40名临床确诊为乳腺癌患者的外周血分离的淋巴细胞，患者年龄分布为20 60岁。步骤(4)中，所述Fd段和轻链基因的克隆及Fab噬菌体抗体库的建立方法为采用先克隆轻链基因后重链基因的策略，通过重叠PCR得到了具有良好多样性的针对乳腺癌患者的Fab片段，再将Fab片段和质粒pComb3XSS用Sfi I酶切，在高浓度连接酶作用下噬菌体载体pCom3XSS与PCR产物的酶切片段连接，电转入感受态细胞后将转化菌均勻涂布于 100 μ g/ml含氨苄青霉素的LB平板，收集所有克隆的质粒DNA，即构建得库容为1 X IO9的人乳腺癌IgGFab噬菌体抗体库。步骤(5)中，所述利用构建的人乳腺癌IgG Fab噬菌体抗体库富集筛选全人源抗 hPRLR抗体的方法如下1、抗hPRLR抗体磁珠活化细胞液相筛选经过数轮细胞筛选并富集的噬菌体抗体库，与磁珠偶联的hPRLR抗原孵育，筛选高特异性的目的抗体；II、Fab抗体可溶性表达、鉴定富集筛选后的阳性克隆，转化宿主细胞使目标抗体表达；III、抗体的分离、纯化和鉴定采用亲和层析获得高纯度、高免疫生物活性的抗体蛋白；对纯化抗体的特异性、生物活性及功能进行鉴定。本发明所用的载体不限于特定的载体，只要它能够与所述基因重组，形成适宜表达的重组质粒即可，优选载体为噬菌体载体。实施实例中，本发明采用一种噬菌体载体质粒 pCOmb3XSS，可以插入编码人免疫球蛋白G(IgG)的轻链基因及重链Fd段基因。本发明所用的宿主细胞不受特别的限制，可选自大肠杆菌、酵母或真核细胞，优选大肠杆菌XLl-Blue为感受态细胞。有益效果本发明与现有技术相比，具有以下优势本发明以DNA重组技术从临床确诊为乳腺癌患者的外周血中扩增出人免疫球蛋白G(IgG)轻链及重链Fdg Vh片段，分别插入噬菌体载体pCOmb3XSS相应位置，构建出天然人源抗乳腺癌IgG Fab噬菌体抗体库；与其他方法构建的噬菌体抗体库相比，该方法建立的噬菌体抗体库是一种应用单载体构建的天然人源 Ig Fab噬菌体抗体库，适用于高通量筛选乳腺癌患者高表达的靶蛋白的全人源抗体，应用针对性强，并具有高容量、高多样性的特点；此外，利用该库筛选获得的以hPRLR为靶向分子的抗乳腺癌全人源化抗体为乳腺癌的生物免疫治疗提供了一种新的抗体药物的候选靶标分子。
图1 :6对重链Fd段可变区基因的PCR扩增产物。其中，M为IOObp Ladder DNAMarker ；1 6分别为以6对引物扩增重链Fd可变区基因的产物(1 =VhI ；2 :VH2 ；3 :VH3 ；4 :VH4 ；5 :VH5 ；6 :VH6)。图2 :4对轻链Vd基因的PCR扩增结果。其中，M为IOObp Ladder DNAMarker ； 1 4分别为以4对引物扩增轻链κ基因的产物(1 :Vlk 1 ；2 :Vlk 2 ；3 :Vlk 3 ；4 =Vlκ 4) 0图3 :9对轻链\λ基因的PCR扩增结果。其中，M为IOObp Ladder DNAMarker ； 1 9分别为9对引物扩增轻链λ基因的产物(1 =VlA 1 ；2 :VlA2 ；3 :VLA3 ；4 :VLA4 ；5 VlA 5 ；6 =VlA 6 ；7 =VlA 7 ；8 :VL λ 8 ;9 :VL λ 9)。图 4 =Fab 基因的 PCR 结果。其中，M 为 IOObp LadderDNAMarker ；1 =Fab ；2 轻链； 3 重链Fd段；4 轻链恒定区；5 重链恒定区；6 轻链可变区；7 重链可变区。图5 :pcomb3XSS质粒载体图。图6 抗hPRLR抗体阳性克隆表达特异抗体蛋白Western-blot鉴定结果。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的技术路线及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 人外周血淋巴细胞分离及总RNA提取分批采集2 40份年龄分布为20 60岁、临床确诊为乳腺癌患者的抗凝外周血各anl，分别以淋巴细胞分离液分离获得外周血淋巴细胞后混合，以灭菌PBS洗涤后重悬细胞，总RNA提纯试剂盒提取外周血淋巴细胞总RNA。实施例2 人免疫球蛋白G (IgG)轻链及重链Fd段基因的扩增先将淋巴细胞总RNA逆转录为cDNA，然后以一组几乎覆盖人免疫球蛋白G (IgG)轻链或重链Fd段Vh和ChI基因片段可变区与恒定区编码序列的特异性引物，对上述反应产物进行PCR以分别扩增人免疫球蛋白G(IgG)，分别用4对κ链基因引物、9对λ链基因引物和6对重链基因引物，扩增可变区。扩增条件为94°C 5min，94°C 1 anin，50 60°C 1 2min,72°C 1 2min，共30个循环，最终延长为72°C IOmin0 PCR产物经2. 0%琼脂糖凝胶电泳鉴定。6对重链可变区基因的扩增结果如图1所示，各组均呈现清晰的目的条带；4对轻链κ基因的扩增结果如图2所示，各组均在350bp出现清晰的目的条带；9对轻链λ基因的扩增结果如图3所示，各组均在350bp出现清晰的目的条带。上述采用的一组覆盖人免疫球蛋白G(IgG)的重链Fd段VH和CH1基因片段可变区和恒定区的特异性引物如下所示 扩增重链Fd段基因可变区的正向引物
HFabVHl-F :GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG HFabVH2-F GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGATCACCTTGAAGGAGTCTGG HFabVH35-F :GCTGCCCAACCAGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGGTGSAGTCTGG HFabVH3a-F GCTGCCCAACCAGCCATGGCCGAGGTGCAGCTGKTGGAGTCTG HFabVH4-F GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG HfabVH4a-F GCTGCCCAACCAGCCATGGCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGG 扩增重链Fd段基因可变区的反向引物
HFabVHJa-B CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCC
HFabVHJb-B CGATGGGCCCTTGGTGGAGGCWGRGGAGACGGTGACCAGGGTBCC扩增重链Fd段基因恒定区的正向引物HIgGCHl-F GCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTC扩增重链Fd段基因恒定区的反向引物dpseq :AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC扩增重链Fd段基因的正向引物Lead VH GCTGCCCAACCAGCCATGGCC扩增重链Fd段基因的反向引物dpseq :AGAAGCGTAGTCCGGAACGTC上述序列中，R= A or G, K = G or T, S = C or G, W = A or T, B = C or G orT。实施例3 天然人源抗乳腺癌IgG Fab噬菌体抗体库的构建采用先克隆轻链基因后重链基因的策略，通过重叠PCR得到了具有良好多样性的针对乳腺癌患者的Fab片段(图4)，Fab长度为1600bp左右，重链Fd段及轻链基因约750bp 左右，轻链、重链的可变区、恒定区均为350bp左右。再将Fab片段和质粒pComb3XSS用Sfi I酶切，在高浓度连接酶作用下PCR产物的酶切片段与噬菌体载体pCom3XSS(由kripps Institute馈赠，图幻连接，电转入感受态细胞后将转化菌均勻涂布于100 μ g/ml含氨苄青霉素的LB平板，收集所有克隆的质粒DNA， 即构建得库容为IXlO9的人乳腺癌IgG Fab噬菌体抗体库。实施例4 天然人源抗乳腺癌IgG Fab噬菌体抗体库的鉴定及多样性分析抗体库DNA分三次转化XLl-Blue感受态细胞，随机挑取克隆，并将其中20株提取质粒DNA，Sfi I的酶切分别获得轻链、重链基因片段，送hvitrogen(上海英潍捷生物技术公司)以ABI 3730DNA测序仪测定核苷酸序列并推算氨基酸序列，测序结果均可找到 Sfi I酶切位点及恒定区序列，并利用Ig BLAST数据库(http://WWW. ncbi. nlm. nih. gov/ igblast/)分析抗体基因的同源家族信息。其中20株中有2个序列相同，说明PCR产物!^ab 多样性在90%左右，多样性较好。实施例5 抗hPRLR噬菌体抗体的筛选、鉴定以hPRLR胞外区为固相抗原对Fab噬菌体抗体库进行六轮筛选，噬菌体抗体收获率由第1轮的5X 10_6增到第6轮的1. 2X 10_3，提高了 240倍(如表1所示)，从而获得了 hPRLR胞外区结合较紧密的噬菌体克隆。表1噬菌体抗体库的富集筛选
权利要求
1.一种人源抗人催乳素受体抗体，其特征在于，它包括重链Fd段可变区和轻链可变区，其中，所述重链Fd段可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No. 4所示。
2.权利要求1所述抗体的编码基因。
3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因如SEQID No. 1和 SEQ ID No. 3 所示。
4.权利要求1所述的人源抗人催乳素受体抗体在制备治疗人乳腺癌药物中的应用。
全文摘要
本发明一种人源抗人催乳素受体抗体，它包括重链Fd段可变区和轻链可变区，其中，所述重链Fd段可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.4所示。本发明还公开了编码上述抗体的基因及上述抗体在制备治疗人乳腺癌药物中的应用。本发明获得了一株具有高特异性和高亲和力的全人源抗hPRLR抗体，在乳腺癌的生物免疫治疗中具有潜在的应用前景。
文档编号A61P35/00GK102250244SQ20111018918
公开日2011年11月23日 申请日期2011年7月7日 优先权日2011年7月7日
发明者姚俊, 曹新, 魏钦俊, 鲁雅洁 申请人:南京医科大学