专利名称：山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重pcr检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明涉及山羊痘病毒和绵羊痘病毒试剂盒，属于动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体涉及一种用于同步进行羊痘病毒属中山羊痘病毒和绵羊痘病毒的双重PCR检测试剂盒和应用试剂盒对山羊痘病毒和绵羊痘病毒进行同步双重PCR检测的生物学检测方法。
背景技术：
山羊痘病毒(Goa^X)X virus)和绵羊痘病毒((Sie印pox virus)均属于羊痘病毒属(Capripoxvirus)，是导致动物羊痘的两种病原，患病羊主要表现为发热，皮肤、黏膜、 器官表面广泛性丘疹或结节，淋巴结肿大，皮肤水肿，感染动物消瘦，产乳量大幅度降低，严重时导致死亡，给养殖业带来较大的危害，造成严重的经济损失。此外，羊痘可以感染人， 因而在公共卫生方面还具有重要意义(Key S J.，2007)。这两种病毒某些分离毒株可同时感染山羊和绵羊(Ahmed A Μ.，2007)，临床症状和发病机理上相似，传统的病原学检测方法操作复杂，不适宜临床诊断，且与其他痘病毒在血清上存在交叉反应，血清型诊断方法难以确诊。近年来，越来越多新型检测技术被应用于山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测和鉴别。 Madhusudan H等人利用PCR-RFLP技术对山羊痘病毒和绵羊痘病毒进行了研究，可以用于这两种病毒的分类及鉴定(Madhusudan H.，2004)。但这种技术在聚合酶链式反应之后还需要对产物进行纯化和酶切，费时费力。而目前国内外其他一些检测技术也不能区别检测这两种病毒，由此发明一种可以同时检测山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测方法，对这两种病毒及羊痘病毒属病毒的研究具有重要意义。在羊痘病毒检测方面，利用单管多重PCR对病原进行同步检测已经有很多的报告，但在兽医诊断方面，尚未有多重检测山羊痘和绵羊痘的检测方法。由于羊痘病毒可以感染人，人使用含有该病毒的肉制品，有患病的可能性，因此对食品安全的监督和检测有重大的意义。病原体的PCR检测需要合成相应的特异PCR扩增引物，并设计适合每对引物的PCR 的扩增条件，即可在临床检测中获得良好的结果，因此，该方法已在国内外的兽医临床检测中广泛应用。针对病原体核酸序列设计的双重PCR，需要针对不同的病原体设计各自特异且保守的寡核苷酸引物，并同时在同一个体系中进行反应，由于引物之间的相互作用的复杂性，故双重PCR扩增体系需要进行各方面条件的优化和调整。由于山羊痘病毒和绵羊痘病毒基因组非常相似，同源性很高，两对特异性引物的设计和PCR条件的设计是发明的核心。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于同步进行山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测和鉴别检测的双重PCR检测试剂盒及检测方法。为了实现上述目的本发明采用如下技术方案山羊痘病毒和绵羊痘病毒在同一 PCR反应体系中进行特异性扩增。山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR检测试剂盒包括Mix PCR反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管。其中所述Mix PCR反应液管由以下反应液组成
序列为SEQ ID NOl的10 mmol/L的上游引物0. 5 μ L ；
序列为SEQ ID Ν02的10 mmol/L的下游引物0. 5 μ L ；
序列为SEQ ID Ν03的10 mmol/L的上游引物0. 5 μ L ；
序列为SEQ ID Ν04的10 mmol/L的下游引物0. 5 μ L ；
10XPCR buffer 缓冲液 2. 5 μ L ；
25 mmol/L MgCl2 2 μ L ；
10 mmol/L dNTP 1 μ L ；
5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0.3 μ L ；
灭菌水14. 2 μ L ；
合计22 μ L，为单次反应的用量。所述阳性对照管，管内为山羊痘病毒和绵羊痘病毒各自的重组质粒，比例为1:1， 2 μ L 20 μ L，其DNA序列如下
山羊痘病毒重组质粒PMD19-T-G的DNA序列为SEQ ID Ν05 ； 绵羊痘病毒重组质粒PMD19-T-S的DNA序列为SEQ ID Ν06。所述阴性对照管，管内为无羊痘病毒感染的山羊肌肉组织DNA样品，2μ L 20 μ Lo所述灭菌去离子水管1 2mL。用所述试剂盒进行山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR检测方法，步骤如下 (1)制备待测样品核酸模板
取100 μ L 200 μ L或IOOmg 200mg待检样品，用商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取待检样品中的基因组DNA，即为待测样品核酸模板；
⑵PCR扩增检测取3 μ L待测样品核酸模板和阴性对照管或3 μ L待测样品核酸模板阳性对照管，分别用Mix PCR反应液管进行PCR扩增； PCR扩增条件是 预变性95 V 5分钟；
循环94 °C变性30秒，53 °C退火30秒，72°C延伸30秒，35个循环； 延伸72 V 5分钟；
(3)结果判定在222bp和177bp位置有两条扩增条带，分别为山羊痘病毒和绵羊痘病毒特异性扩增条带，表示山羊痘病毒和绵羊痘病毒呈阳性；在这两处位置无可见扩增带，表示山羊痘病毒和绵羊痘病毒呈阴性。在本发明的PCR扩增引物的设计上，遵循一般的引物设计要求，设计和针对山羊痘病毒和绵羊痘病毒的特异性引物，且保证在相同的退火温度下均能获得较好的扩增。针对特异性引物在扩增靶序列内部的不同位置，从而可以方便地通过扩增片段的长度的不同
鉴别出山羊痘病毒和绵羊痘病毒。本发明的优点是(1)本发明可以快速地对待检样品是否感染山羊痘病毒和绵羊痘病毒进行鉴定和鉴别检测，具有较高的灵敏度。本发明可以组装成临床检测山羊痘病毒和绵羊痘病毒病原的双重PCR检测试剂盒，供兽医临床和实验室检测所用。(2)本发明提供的扩增试剂均经试验反复验证和优化，具有市场上同类PCR检测试剂盒相应优点。归纳起来为1)特异性号本发明对非羊痘病毒属病毒DNA无扩增，假阳性率低。2)灵敏度高本发明对山羊痘病毒和绵羊痘病毒检测的最低检测量分别约为17. 5 pg/μ L 禾口 18. 75 pg/μ Lo
图1双重PCR扩增电泳； 图2双重PCR特异性试验电泳； 图3双重PCR灵敏度试验电泳；
图1中1-山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR扩增条带；2-阴性对照；M-DL 2000 DNA Marker ；
图2中1 7 =LSDV, CPV、大肠杆菌0157、沙门氏菌、羊组织、牛组织、SPPV, GTPV单重 PCR ；8 =SPPV 和 GTPV 双重 PCR ；9 空白对照；M :DL 2000 DNA Marker ；
图 3 中1-17.5 ng/μ L GTPV, 18. 75 ng/μ L SPPV ；2-1. 75 ng/μ L GTPV, 1. 875 ng/ μ L SPPV ；3-0.175 ng/μ L GTPV,0. 1875ng/μ L SPPV ；4-17.5 pg/μ L GTPV,18. 75 pg/ μ L SPPV ；5-1. 75pg/y L GTPV, 1. 875pg/μ L SPPV ；6-0. 175 pg/μ L GTPV，0. 1875pg/μ L SPPV ；M :DL 2000 DNA Marker。
具体实施例方式实施例1、本发明引物的设计及筛选
根据已知的山羊痘病毒核酸序列和绵羊痘病毒核酸序列的基因组全长序列，利用应用 Clustff软件进行多重比对，用I^rimer Premier 5. 0软件设计特异性引物，分别标记为SEQ ID NOl……SEQ ID N04。所有引物均由宝生物工程(大连)有限公司合成。用核酸提取试剂盒分别提取山羊痘病毒和绵羊痘病毒细胞毒DNA，采用权利要求1设计的引物分别扩增， 排除有非特异性扩增的引物。获得引物
权利要求
1.山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR检测试剂盒，其特征是它包括MixPCR反应液管、阳性对照管、阴性对照管和灭菌去离子水管，其中所述Mix PCR反应液管由以下反应液组成序列为SEQ ID NOl的10 mmol/L的上游引物0. 5 μ L ；序列为SEQ ID Ν02的10 mmol/L的下游引物0. 5 μ L ；序列为SEQ ID Ν03的10 mmol/L的上游引物0. 5 μ L ；序列为SEQ ID Ν04的10 mmol/L的下游引物0. 5 μ L ；10XPCR buffer 缓冲液 2. 5 μ L ；25 mmol/L MgCl2 2 μ L ；10 mmol/L dNTP 1 μ L ；5U/ μ L Taq DNA 聚合酶 0.3 μ L ；灭菌水14. 2 μ L ；合计22 μ L，为单次反应的用量；所述阳性对照管管内为山羊痘病毒和绵羊痘病毒各自的重组质粒，比例为1:1， 2 μ L 20 μ L，其DNA序列如下山羊痘病毒重组质粒PMD19-T-G的DNA序列为SEQ ID Ν05 ；绵羊痘病毒重组质粒PMD19-T-S的DNA序列为SEQ ID Ν06 ；所述阴性对照管管内为无羊痘病毒感染的山羊肌肉组织DNA样品，2 μ L 20 μ L ；所述灭菌去离子水管1 2mL。
2.权利要求1所述试剂盒，其特征是山羊痘病毒和绵羊痘病毒在同一PCR反应体系中进行特异性扩增，根据扩增片段的大小，将山羊痘病毒和绵羊痘病毒鉴别与区分。
3.权利要求1所述试剂盒用于的山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR检测方法，步骤如下(1)制备待测样品核酸模板取100 μ L 200 μ L或IOOmg 200mg待检样品，用商品化核酸提取试剂盒或实验室常规使用的提取病毒核酸的方法提取待检样品中的基因组DNA，即为待测样品核酸模板；⑵PCR扩增检测取3 μ L待测样品核酸模板和阴性对照管或3 μ L待测样品核酸模板阳性对照管，分别用Mix PCR反应液管进行PCR扩增； PCR扩增条件是 预变性95 V 5分钟；循环94 °C变性30秒，53 °C退火30秒，72°C延伸30秒，35个循环； 延伸-J2 V 5分钟；(3)结果判定在222bp和177bp位置有两条扩增条带，分别为山羊痘病毒和绵羊痘病毒特异性扩增条带，表示山羊痘病毒和绵羊痘病毒呈阳性；在这两处位置无可见扩增带，表示山羊痘病毒和绵羊痘病毒呈阴性。
全文摘要
本发明公开了一种用于山羊痘病毒和绵羊痘病毒双重PCR检测试剂盒和用于山羊痘病毒和绵羊痘病毒快速鉴别检测的双重PCR方法。根据山羊痘病毒和绵羊痘病毒的基因组序列各设计一对PCR引物，可以扩增出相对应的特异性片段，实现对山羊痘病毒和绵羊痘病毒的检测与鉴别。本发明利用双重PCR技术，单管同步检测山羊痘病毒和绵羊痘病毒，降低了对山羊痘和绵羊痘的检测成本和工作量，实现了对山羊痘和绵羊痘的鉴别检测。本发明建立了一种特异性强、灵敏度高、节时省力并且易于观察结果的双重PCR方法，操作简便，特异性强、灵敏度高、可重复性高，且没有复杂的后处理。
文档编号C12R1/93GK102367492SQ20111037578
公开日2012年3月7日 申请日期2011年11月23日 优先权日2011年11月23日
发明者李应国, 李贤良, 杨俊 , 王国民, 王昱, 聂福平, 肖进文, 肖雯 申请人:李应国, 重庆出入境检验检疫局检验检疫技术中心